Cr（VI）還原微生物篩選、分離及鑒定

王思雅　左群　劉朝陽(yáng)　皮海廷　李寧

摘 要：[目標(biāo)]本文以分離并獲得具有Cr（VI）耐受、還原能力的微生物為目標(biāo)，[方法]從受污染土壤提取液中富集Cr（Ⅵ）耐受菌株，并對(duì)其進(jìn)行分離、鑒定。[結(jié)果]實(shí)驗(yàn)共篩選出四株具有Cr（VI）耐受、還原菌株，其中2株菌株的Cr（VI）耐受能力較好，W1菌株和W3菌株。這兩株菌株均能在鉻濃度為100mg/L的培養(yǎng)液中生存，且具有一定的還原Cr的能力。[意義]這兩株菌株的篩選、分離與鑒定豐富了處理鉻污染微生物的生物資料，對(duì)微生物處理重金屬污染具有重大意義。

關(guān)鍵詞：鉻污染;耐受菌;篩選;鑒定

Screening，Isolation And Identification of Microorganisms With Chromium Tolerance

Wang Siya1 Zuo Qun2 Liu Chaoyang 1 Pi Haiting2 Li Ning1*

1.School of water conservancy and environment HubeiYichang 443002;

2.College of biology and pharmacy，three gorges university HubeiYichang 443002

Abstract：This paper separation，screening and identification of microorganisms capable of strong resistance to chromium target.By the extract of contaminated soil Cr（Ⅵ）strains screened tolerance，and carries on the separation，Enrichment and detection of PCR.[results]a total of four tolerant strains were screened out in the experiment，but two of them were in poor growth condition，so only the W1 strains and W3 strains with good growth condition were retained.These two strains can survive in the culture solution with chromium concentration of 100mg/L.[Significance]The screening，isolation and identification of these two strains greatly enriched the biological data for treating chromium contaminated microorganisms，which was of great significance for microbial treatment of heavy metal pollution.

Key words：chromium pollution;tolerance;screening;appraisal

如今隨著人們?cè)谏a(chǎn)生活中的快速發(fā)展，重金屬Cr的污染源逐漸增多，Cr污染土地面積持續(xù)擴(kuò)大，土壤Cr含量也持續(xù)增高。[1]調(diào)查報(bào)告顯示，全國(guó)土壤總污染超標(biāo)率為16.1%，其中Cr（Ⅵ）污染超標(biāo)率已達(dá)1.1%，處于無(wú)機(jī)污染物點(diǎn)位超標(biāo)率的前八位，污染范圍較大。[2]

重金屬Cr污染對(duì)人類社會(huì)有著嚴(yán)重的不良影響。土壤中過(guò)多的重金屬進(jìn)入農(nóng)作物種會(huì)富集在農(nóng)作物中，影響農(nóng)作物的品質(zhì)。同時(shí)，Cr（Ⅵ）為一種吸入性和吞入性毒物，生物富集性強(qiáng)，可以導(dǎo)致過(guò)敏、甚至遺傳性基因受損，是世界癌癥協(xié)會(huì)確認(rèn)的重要致癌物質(zhì)，[3]對(duì)人類生命安全有著巨大威脅。因此，Cr污染已經(jīng)成為急需解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，我國(guó)土壤重金屬污染問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，人們對(duì)于處理土壤重金屬污染的方法也愈加關(guān)注。傳統(tǒng)的Cr處理方法占地面積大、成本高且容易引發(fā)二次污染。

目前，有一些 Cr（Ⅵ）還原菌已經(jīng)被分離出來(lái)，如Leucobacter sp.CRBl，可以在 38h 內(nèi)完全還原 1820mg·L-1的Cr（Ⅵ）。[4]在韓懷芬等進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，將5種可以還原 Cr（Ⅵ）的細(xì)菌混合后對(duì)于Cr（Ⅵ）的處理能力最高能達(dá)到100%。[5]同時(shí)，微生物法處理Cr污染具有出水水質(zhì)好、反應(yīng)溫和并且可以同時(shí)處理多種重金屬的優(yōu)勢(shì)，因而越來(lái)越受到歡迎。[6，7]使用微生物法處理Cr需要具有強(qiáng)耐Cr性且具有較好的處理Cr功能的微生物菌株。而這些菌群需要我們通過(guò)篩選、分離來(lái)確定。本實(shí)驗(yàn)利用受到重金屬Cr污染的土壤中獲取的菌群提取液來(lái)進(jìn)行耐Cr菌株的篩選、分離，并進(jìn)行鑒定、制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1 材料與方法

本次實(shí)驗(yàn)所用接種液是通過(guò)從受到重金屬Cr污染的土壤中獲取的菌群進(jìn)行液體培養(yǎng)、并在4攝氏度冰箱保存15天所得，各項(xiàng)生化性質(zhì)良好。

耐鉻菌株的篩選、分離與純化培養(yǎng)基采用PCS培養(yǎng)基，并在40℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行篩選，在28℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行富集培養(yǎng)。

1.1 菌株篩選

用滅過(guò)菌的100mL錐形瓶從發(fā)酵罐內(nèi)取得少量發(fā)酵液。用無(wú)菌水稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7。

取一支0.5mL無(wú)菌移液管，從濃度小的10-7菌液開(kāi)始，以10-7、10-6、10-5、10-4為序，分別吸取0.5mL于培養(yǎng)皿內(nèi)，并做好標(biāo)記。每次吸取前，使菌液充分混勻。

將已融化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，順時(shí)針和逆時(shí)針來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于40℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并觀察結(jié)果。

1.2 菌株富集

將已經(jīng)分離得到的單菌株樣本，進(jìn)行3至4代的傳代培養(yǎng)，至沒(méi)有其他雜菌的存在。再進(jìn)行多批量的劃線培養(yǎng)，生長(zhǎng)2到4天后作為菌種保存于冰箱。

1.3 耐Cr菌株的鑒定

觀察篩選菌株的菌落大小、菌落表面以及顏色等形態(tài)特征。并對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，確定菌株的革蘭氏陰陽(yáng)性。最后對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定，分析其同源性，制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離

通過(guò)使用PCS培養(yǎng)基對(duì)菌群中的細(xì)菌進(jìn)行篩選后，我們共獲得了四種對(duì)高濃度Cr（VI）離子具有耐受性的菌株。并對(duì)獲得的菌株進(jìn)行分離、富集培養(yǎng)，編號(hào)1～4號(hào)菌。

2.2 菌株的形態(tài)特征

1號(hào)菌培養(yǎng)24h后，可在平板上觀察到白色芝麻大小的菌落。72h后，可在平版表面觀察到綠豆大小呈凸出狀的白色不透明菌落。生長(zhǎng)狀況良好，易于觀察和取樣。

2號(hào)菌培養(yǎng)24h后，可用肉眼觀察到有數(shù)量較少的扁平透明的菌落出現(xiàn)。72h后，菌落由扁平透明變?yōu)榫G豆大小的白色不透明菌落，數(shù)量明顯增加。生長(zhǎng)狀況良好，易于觀察和取樣。

3號(hào)菌培養(yǎng)24h后，難以用肉眼觀察到明顯菌落。48h后，可觀察到有數(shù)量較多的呈輻射狀生長(zhǎng)的白色透明菌落。72h后，菌落呈黃豆大小的白色透明菌落，菌落邊緣出現(xiàn)褶皺。菌落數(shù)量少于1號(hào)菌和2號(hào)菌，生長(zhǎng)狀況一般。

4號(hào)菌培養(yǎng)24h后，基本無(wú)明顯菌落。48h后可觀察到芝麻大小的白色透明菌落。72h后，菌落數(shù)量增加，但菌落大小基本無(wú)變化。菌落數(shù)量多于3號(hào)菌，但少于1號(hào)菌和2號(hào)菌。

（a）（b）

（c）（d）

a：1號(hào)菌平板;b：2號(hào)菌平板;c：3號(hào)菌平板;d：4號(hào)菌平板

圖1 菌株的平板圖

2.2 菌的生長(zhǎng)情況預(yù)實(shí)驗(yàn)

對(duì)菌種的生化特性進(jìn)行研究前，設(shè)置了對(duì)比菌種生長(zhǎng)狀況的預(yù)實(shí)驗(yàn)。將4種細(xì)菌分別接種到pH=8.5的含100mg/L Cr（VI）PCS液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24h測(cè)定一次細(xì)菌濃度。

圖2 菌株的生長(zhǎng)狀況

由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，1號(hào)菌和2號(hào)菌生長(zhǎng)狀況較好，72h時(shí)，最大菌濃可達(dá)到0.35以上。而3號(hào)菌和4號(hào)菌生長(zhǎng)狀況一般，96h最大菌濃僅為0.135，表現(xiàn)出3號(hào)菌和4號(hào)菌對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)能力較差。故對(duì)于生物理化性質(zhì)的研究及鑒定等僅考慮1號(hào)菌和2號(hào)菌。

2.3 生物鑒定

對(duì)于1號(hào)菌和2號(hào)菌，抽取總DNA，針對(duì)16S rDNA進(jìn)行進(jìn)行PCR檢測(cè)，所獲得的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLST，并根據(jù)BLST結(jié)果利用MEGAX繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖3，1號(hào)和2號(hào)細(xì)菌同屬于Delftia屬微生物，該類微生物的部分菌株在還原重金屬中發(fā)揮作用。

圖3 菌株的生長(zhǎng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)菌群的篩選與分離獲得4株耐鉻菌株，并通過(guò)觀察單菌生長(zhǎng)，選擇對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較好的1號(hào)菌和2號(hào)菌作為研究菌株。并將1號(hào)菌株和2號(hào)菌株分別命名為W1與W3。W1菌和W3菌具有良好的耐鉻性和還原鉻的能力，它們能夠在100mg/L Cr（VI）的培養(yǎng)液中良好生長(zhǎng)。耐鉻菌株的分離與發(fā)現(xiàn)豐富了處理鉻污染微生物的生物資料，對(duì)微生物法處理重金屬污染具有重大意義。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡(jiǎn)介：王思雅（1999-），女，本科，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。

通訊作者：李寧（1978-），女，副教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。