高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定兒童彩泥類造型玩具中3種異噻唑啉酮類防腐劑

王 瑾，任潔芳，張東雷，周 敏，李祖光，張慧敏

(1.浙江省產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)研究院，浙江 杭州 310018;2.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

異噻唑啉酮類化合物是一種廣譜、高效、非氧化性殺菌防腐劑，該化合物穩(wěn)定性強(qiáng)、使用成本低，廣泛應(yīng)用于玩具、紡織品、造紙、皮革、涂料、化妝品等行業(yè)[1-5]，其中常見的有2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)和1,2-苯并異噻唑啉-3-酮(BIT)等。研究表明，該類物質(zhì)是一類致敏劑，可能引起過敏或皮炎等反應(yīng)，過量接觸還可導(dǎo)致皮膚灼傷，其中以MI和CMI的致敏性和刺激性最強(qiáng)[6-7]。國內(nèi)外對(duì)食品接觸材料、化妝品、玩具等日用品中異噻唑啉酮類防腐劑的使用制定了嚴(yán)格的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。歐盟玩具協(xié)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)EN 71-9-2005[8]中明確限定了MI、CMI和BIT在玩具皮革、玩具中的液體、造型粘土及類似物等玩具材料中的限量分別為10、10、5 mg/kg，且MI和CMI的總限量為15 mg/kg。

目前，異噻唑啉酮類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有分光光度法[9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]、液相色譜[14-15]和LC-MS/MS[16-18]等。歐盟玩具協(xié)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)EN 71-10[19]和EN 71-11[20]分別詳細(xì)說明了異噻唑啉酮類化合物的提取和測(cè)定方法，以去離子水萃取玩具材料中的目標(biāo)物后，采用液相色譜-紫外檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定，但該方法靈敏度低，方法定量下限即為限量要求，且易出現(xiàn)假陽性，無法滿足檢測(cè)需求。而LC-MS/MS因分析時(shí)間短、選擇性好、靈敏度高，更適用于復(fù)雜體系中高沸點(diǎn)或熱穩(wěn)定性差等物質(zhì)的測(cè)定，同時(shí)隨著色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器普及率也較高，樣品預(yù)處理也相對(duì)簡(jiǎn)單。然而，應(yīng)用HPLC-MS/MS測(cè)定彩泥類造型玩具中異噻唑啉酮類物質(zhì)的檢測(cè)未見報(bào)道。因此，本文建立了一套簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定兒童彩泥類造型玩具中異噻唑啉酮類物質(zhì)的HPLC-MS/MS分析方法，該方法可滿足歐盟玩具標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)限量要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP?5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)，LC-20ADXR高效液相色譜儀(日本島津公司)，Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma公司)，渦旋振蕩器(IKA公司)，超聲波清潔器(上?？茖?dǎo)公司)，電子天平(梅特勒-托利多公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：MI(純度97.01%)，CMI(純度98.51%)，BIT(純度99.58%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

甲醇(色譜純，Merck 公司)，乙酸銨(色譜級(jí)，≥99.0%，Aladdin公司)，實(shí)驗(yàn)用水均符合GB/T 6682-2008[21]的實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg(精確至0.1 mg)MI、CMI、BIT標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成1 000 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18 ℃棕色玻璃瓶中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取1 000 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL于10 mL容量瓶，甲醇稀釋定容，得10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃棕色玻璃瓶中保存；再將10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋至1 mg/L，得1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

空白基質(zhì)提取液：樣品按照“1.3”條件進(jìn)行前處理和儀器分析，確定樣品為陰性樣品，其提取液可作為空白基質(zhì)提取液。

溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲醇-水(1∶1，體積比)稀釋，配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白基質(zhì)提取液稀釋，配制成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.50 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，加入15.0 mL甲醇，超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確移取上清液1.0 mL，用水1∶1稀釋，渦旋混勻后過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

若按上述前處理過程，提取液中分析物濃度超出方法的線性范圍時(shí)，則需用甲醇-水(1∶1，體積比)進(jìn)行必要的稀釋處理。

1.4 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：色譜柱Kinetex?C18柱(100 mm×3 mm，2.6 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：300 μL/min；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水，梯度洗脫：0～2.0 min，20%A；2.0～4.0 min，20%～80%A；4.0～8.0 min，80%A；8.0～9.0 min，80%～20%A；9.0～10.0 min,20%A。

表1 MI、CMI、BIT的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS/MS acquisition parameters of MI，CMI and BIT

*quantitative ion pair

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：550 ℃；霧化氣：0.38 MPa；輔助氣：0.38 MPa；氣簾氣：0.24 MPa；噴霧電壓：5 000 V，質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜-色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化MI、CMI、BIT 3種化合物的結(jié)構(gòu)中均含氮基團(tuán)，易結(jié)合質(zhì)子得到正離子，因此選擇電噴霧電離正離子模式(ESI+)。分別配制50 μg/L的MI、CMI、BIT單標(biāo)溶液，采用針泵進(jìn)樣模式，進(jìn)行一級(jí)母離子掃描，獲得準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+。選擇3種化合物的母離子(MI：m/z115.9、CMI：m/z149.9、BIT：m/z152.0),對(duì)每個(gè)母離子分別進(jìn)行二級(jí)碎片掃描，得到碎片的離子信息，選取2個(gè)響應(yīng)較大的碎片作為子離子，建立MRM離子對(duì)，分別優(yōu)化DP、CE電壓值，3種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 MI、CMI和BIT的總離子流色譜圖Fig 1 Total ion chromatogram of MI，CMI and BIT

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用Kinetex?C18柱(100 mm×3 mm，2.6 μm)進(jìn)行分離，以甲醇-水為流動(dòng)相，考察了甲醇-水的兩相比例及梯度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水(20∶80)、甲醇-水(30∶70)等度洗脫時(shí)，BIT的峰形差；當(dāng)采取梯度洗脫程序時(shí)，3種異噻唑啉酮類物質(zhì)在10 min內(nèi)有較好的分離度和峰形。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了相同梯度洗脫條件下，甲醇-水和甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液的分離效果，結(jié)果表明，甲醇-2 mmol/L乙酸銨梯度洗脫時(shí)，3種化合物的峰形較好，可有效降低基線背景，但響應(yīng)強(qiáng)度低；而以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，3種化合物的峰形好、響應(yīng)強(qiáng)度高。因此，最終選用甲醇-水作為流動(dòng)相，在梯度洗脫程序下，10 min內(nèi)可完成分析，MI、CMI、BIT的保留時(shí)間分別為1.91、4.86、5.59 min。圖1為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，5.0 μg/L異噻唑啉酮類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化選擇超輕粘土、水晶泥陽性樣品進(jìn)行提取溶劑的優(yōu)化，由于異噻唑啉酮類化合物易溶于水、甲醇等有機(jī)溶劑，因此本實(shí)驗(yàn)比較了水、甲醇、甲醇-水(1∶1，體積比)3種提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，甲醇的提取效率明顯優(yōu)于其他兩種溶劑，因此選擇甲醇作為最佳提取溶劑。

2.2.2 超聲提取時(shí)間的選擇以甲醇為提取溶劑，比較了不同超聲提取時(shí)間(5、10、20、30、40 min)對(duì)3種化合物提取效率的影響。結(jié)果顯示，隨超聲時(shí)間的延長，3種化合物的提取效率增大，超聲30 min后，繼續(xù)延長超聲時(shí)間，3種化合物的提取效率基本不變，故選擇最佳超聲時(shí)間為30 min。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)物以外的組分對(duì)目標(biāo)物測(cè)定值的影響，一般有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)減弱效應(yīng)。在色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中，需對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采取措施，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。降低基質(zhì)效應(yīng)的常見方法有稀釋樣品溶液、增加凈化步驟、優(yōu)化色譜分離條件、采用同位素內(nèi)標(biāo)、配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液等[22]。本實(shí)驗(yàn)考察了3種化合物在兩類造型玩具(水晶泥、超輕粘土)中的基質(zhì)效應(yīng)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比較法，即使用相對(duì)響應(yīng)值法研究不同樣品對(duì)3種異噻唑啉酮類防腐劑的基質(zhì)效應(yīng)，根據(jù)公式Me=Am/Ac×100%進(jìn)行量化評(píng)估，式中Me表示基質(zhì)效應(yīng)，Am表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，Ac表示純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)Me<100%時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)Me大于100%時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。當(dāng)90%≤Me≤110%為弱基質(zhì)效應(yīng)，無需采取補(bǔ)償措施。結(jié)果顯示，對(duì)于水晶泥樣品，MI的基質(zhì)效應(yīng)最明顯；對(duì)于超輕粘土樣品，MI、CMI的基質(zhì)效應(yīng)明顯(見表2)。為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

針對(duì)異噻唑啉酮類防腐劑含量較高的樣品，提取液上機(jī)濃度已超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，需對(duì)提取液進(jìn)行必要的稀釋處理。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取液稀釋10倍后進(jìn)樣時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)影響較小，可不考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較Table 2 Comparison of matrix-matched calibration and solvent calibration

*:no data

2.3.2 線性范圍與檢出限在優(yōu)化條件下，按“1.2”配制MI、CMI、BIT的系列濃度基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定后，以定量離子峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分析物質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。MI、CMI、BIT在甲醇-水、水晶泥基質(zhì)、超輕粘土基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD,S/N=3)及定量下限(LOQ,S/N=10)列于表2。結(jié)果顯示，MI、CMI、BIT均在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 0，MI、CMI和BIT的儀器定量下限分別為0.5、0.5、1.0 μg//L，方法檢出限分別為10、10、20 μg/kg，方法定量下限分別為30、30、60 μg/kg。

2.3.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在水晶泥、超輕粘土陰性樣品中分別添加0.06、0.6、2.0 mg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，指畫顏料陽性樣品中分別添加4、8、10 mg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平加標(biāo)5次，按優(yōu)化方法進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)?？紤]基質(zhì)效應(yīng)，其中水晶泥、超輕粘土陰性樣品用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，指畫顏料陽性樣品用甲醇-水配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：MI、CMI、BIT的平均回收率為80.2%～109%，RSD不大于8%，方法的準(zhǔn)確度及精密度均滿足日常檢測(cè)的需求。

表3 不同基質(zhì)中 MI、CMI和BIT的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of MI,CMI,BIT in different matrixes

*no detected

2.3.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)取市售15種兒童彩泥類造型玩具，采用本方法測(cè)定樣品中MI、CMI和BIT含量。結(jié)果顯示，7批次產(chǎn)品中檢出異噻唑啉酮類防腐劑(如表5)，檢出樣品包括水晶泥類、超輕粘土類和指畫顏料類，其中有3批次超出了歐盟玩具指令中規(guī)定的限量要求。

表5 7種兒童彩泥類造型玩具中3種異噻唑啉酮類防腐劑的含量Table 5 Contents of three isothiazolinone preservatives in 7 samples of modeling toys

*no detected

3 結(jié) 論

本文建立了HPLC-MS/MS快速測(cè)定兒童彩泥類造型玩具中3種異噻唑啉酮類防腐劑的分析方法。該方法簡(jiǎn)單、靈敏，具有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，方法的檢出限和定量下限可滿足歐盟玩具協(xié)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)EN 71-9:2005+A1:2007中對(duì)3種防腐劑的限量要求。應(yīng)用本方法對(duì)15批彩泥類造型玩具樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢出7批次陽性樣品，其中3批次超出限量要求，說明該類玩具在生產(chǎn)過程中存在超量使用3種異噻唑啉酮類防腐劑的情況，存在安全風(fēng)險(xiǎn)，政府應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。