飲料及配制酒中11種有機(jī)合成色素的低共熔溶劑萃取/高效液相色譜法測(cè)定

周 佳，禹 潔，朱書強(qiáng)，邵永華,黃 韡，祖 新

(甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030)

我國(guó)允許添加的有機(jī)合成色素包括新紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)、赤蘚紅、喹啉黃等11種。其中，喹啉黃為2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽和2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽的混合物，一鈉鹽和二鈉鹽各存在2個(gè)同分異構(gòu)體[1]，所以喹啉黃的含量按照4種混合物的加和值進(jìn)行計(jì)算。

有機(jī)合成色素大多由萘酚、對(duì)氨基苯磺酸化合而成，在人體內(nèi)可代謝產(chǎn)生強(qiáng)致癌性物質(zhì)，尤其是偶氮類合成色素，進(jìn)入人體后在偶氮還原酶的作用下會(huì)生成芳香胺類化合物，并與靶細(xì)胞作用引起癌癥[2-3]。研究表明，長(zhǎng)期攝入含有機(jī)合成色素的食品會(huì)引起過(guò)敏癥(哮喘、鼻炎等)，導(dǎo)致兒童出現(xiàn)脾氣暴躁、注意力下降、多動(dòng)癥等癥狀，甚至?xí)绊懫渲橇4]。GB 2760-2014標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了相關(guān)添加劑的使用范圍及限量[5]。但受利益的驅(qū)使，超范圍、超標(biāo)使用有機(jī)合成色素的情況時(shí)有發(fā)生。綜上，為了老百姓舌尖上的安全，檢測(cè)有機(jī)合成色素是非常有必要的。目前檢測(cè)有機(jī)合成色素的方法有高效液相色譜法[1,6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1，8-9]、分光光度法[10]和薄層色譜法[11]等。但上述方法存在前處理步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑用量大、目標(biāo)物損失大等缺點(diǎn)。

綠色溶劑作為一種環(huán)境友好的新型萃取溶劑，近年來(lái)日益受到關(guān)注。其中，低共熔溶劑(DES)是由氫鍵受體(季銨鹽)與氫鍵供體(醇、酸等)通過(guò)氫鍵作用形成的液體混合物[12-14]。按照溶解性的不同，DES可分為親水性和疏水性。由于其具有生物降解性、不可燃性、價(jià)廉、易制備、環(huán)境友好等特點(diǎn)[15]，受到了廣泛應(yīng)用[16]。例如，以氯化膽堿和乙二醇合成的DES萃取調(diào)味油中的酸性橙Ⅱ、堿性橙21和堿性橙22[17]；以氯化膽堿和乳酸合成的DES萃取香茶藨子葉片中總酚酸、總黃酮[18]；以氯化膽堿和甘油合成的DES萃取食用油中鉛和鎘[19-20]等。然而，上述研究多采用親水性DES進(jìn)行目標(biāo)物萃取，并不適用于水基樣品。

本研究以四丁基氯化銨和辛酸為原料合成疏水性DES，并將其作為萃取溶劑，建立了飲料、配制酒中新紅、檸檬黃等11種有機(jī)合成色素的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)(HPLC-DAD)分析方法。與傳統(tǒng)方法相比，本方法操作步驟更簡(jiǎn)單、檢測(cè)損失更少、目標(biāo)物種類更多。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

四辛基氯化銨、四甲基氯化銨、四丁基氯化銨、1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽(上海成捷化學(xué)有限公司)。標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)、赤蘚紅、新紅、喹啉黃(純度>98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)，甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，癸酸、辛酸、水楊酸(分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。去離子水由GenPure UV-TOC/UF×CAD plus超純水機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)制備。

液體樣品均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?。碳酸飲料、茶飲料、配制酒樣品直接使用，果蔬汁飲料、蛋白飲料樣品稀?0倍，離心后取上清液作為樣品待測(cè)液。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司，配DAD檢測(cè)器)；控溫磁力攪拌器、Genius 3渦旋儀(德國(guó)IKA公司)；玻璃注射器(10 mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；液相微量進(jìn)樣針(10 μL,日本島津公司)。

1.3 溶液的配制

分別稱取適量11種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以去離子水溶解配制成單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 μg/mL)，并于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

分別吸取各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以去離子水溶解配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、酸性紅、靛藍(lán)、赤蘚紅、新紅、喹啉黃3(QYNa Ⅰ)、喹啉黃4(QYNa Ⅱ)的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，喹啉黃1(QYNa2Ⅰ)、亮藍(lán)為2.0 μg/mL，喹啉黃2(QYNa2Ⅱ)為4.0 μg/mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 低共熔溶劑的制備按照表1制備低共熔溶劑，分別稱取氫鍵供體和氫鍵受體于25 mL圓底燒瓶中，在40 ℃油浴中加熱至兩種混合物變成透明澄清液體，自然冷卻至室溫后備用。

表1 低共熔溶劑的合成條件Table 1 Synthesis conditions of deep eutectic solvents

(續(xù)表1)

No.Hydrogen bond acceptorHydrogen bond donorMole ratioDES-6Tetraoctyl ammonium bromide(四辛基溴化銨)Octanoic acid(辛酸)DES-71-Ethyl-3-methylimidazolium chloride(1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽)Octanoic acid(辛酸)DES-81-Ethyl-3-methylimidazolium chloride(1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽)Decanoic acid(癸酸)DES-91-Ethyl-3-methylimidazolium chloride(1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽)Salicylic acid(水楊酸)DES-101-Hexyl-3-methylimidazolium chloride(1-己基-3-甲基咪唑氯鹽)Octanoic acid(辛酸)DES-111-Hexyl-3-methylimidazolium chloride(1-己基-3-甲基咪唑氯鹽)Decanoic acid(癸酸)DES-121-Hexyl-3-methylimidazolium chloride(1-己基-3-甲基咪唑氯鹽)Salicylic acid(水楊酸)

1.4.2 目標(biāo)物的萃取將200 μL疏水性DES置于10 mL玻璃注射器中,準(zhǔn)確吸取5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(或樣品待測(cè)液)注入上述玻璃注射器，渦旋2 min。靜置3 min,將油狀液滴推至注射器口，用微量進(jìn)樣針吸取疏水性DES于2 mL壓蓋離心管，以甲醇溶解并定容至0.5 mL,過(guò)0.45 μm微孔有機(jī)濾膜后，待測(cè)。

1.4.3 色譜條件色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm,日本資生堂)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;流動(dòng)相：A為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇，流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序：0.01～7.00 min，20%～35%B；7.00～9.00 min，35%～80%B；9.00～19.00 min，80%～95%B；在0.01 min內(nèi)線性遞減至20%B，保持6 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性低共熔溶劑的選擇

采用表1中合成的12種DES對(duì)11種目標(biāo)物進(jìn)行特異性吸附試驗(yàn)，結(jié)果顯示，DES-6無(wú)吸附效果；DES-4、DES-7與目標(biāo)物發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而使溶液顏色消退；DES-8、DES-9、DES-11對(duì)目標(biāo)物有輕微的吸附效果，但DES析出并上浮；DES-3、DES-12對(duì)目標(biāo)物有輕微的吸附效果，但DES析出并沉淀；DES-1、DES-2、DES-5、DES-10對(duì)目標(biāo)物有明顯吸附，且呈油狀液體懸浮于樣品中。

進(jìn)一步對(duì)比了DES-1、DES-2、DES-5、DES-10的萃取效率，結(jié)果表明DES-1的萃取效率最佳且易于吸取，DES-2的萃取效率次之但不易吸取。DES-1的液體黏度及表面張力相對(duì)最低，有助于提高DES液滴在水中的分散性，從而提高目標(biāo)物的萃取率。這是因?yàn)镈ES烷基鏈長(zhǎng)度的增加會(huì)導(dǎo)致黏度增大，不利于其在水中分散；同時(shí)由于目標(biāo)物均為水溶性，按照相似相溶理論，DES碳鏈越長(zhǎng)，則極性越弱越難萃取目標(biāo)物，因此萃取效率會(huì)下降。綜上，最終選用經(jīng)四丁基氯化銨和辛酸合成的DES-1作為特異性低共熔溶劑。

2.2 萃取容器的選擇

圖1 低共熔溶劑用量對(duì)11種目標(biāo)物萃取效率的影響Fig.1 Effect of deep eutectic solvent amount on the extraction efficiencies of 11 analytesa：lemon yellow；b：new red；c：amaranth；d：indigo；e：carmine；f：QYNa2 I；g：sunset yellow；h：QYNa2 Ⅱ；i:allura red；j：brilliant blue；k：acid red；l:QYNa I；m:QYNa Ⅱ；n：erythrosine

由于DES多為油狀液滴，易粘附在容器壁上，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)萃取容器進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，以塑料注射器為萃取容器時(shí)，DES附著于器壁上，不利于目標(biāo)物的測(cè)定。而以玻璃注射器為萃取容器時(shí)，DES吸附目標(biāo)物并凝結(jié)為油狀液滴浮于上層，易于分離測(cè)試。故選用玻璃注射器作為萃取容器。

2.3 低共熔溶劑用量的選擇

參照GB 2760-2014[5]對(duì)有機(jī)合成色素的限量要求，并根據(jù)實(shí)際樣品中有機(jī)合成色素的含量，考察了DES用量對(duì)11種目標(biāo)物萃取效率的影響。由圖1可知，當(dāng)DES的用量為50 μL時(shí)，檸檬黃的萃取率達(dá)98%；當(dāng)增加DES的用量至150 μL時(shí)，新紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、酸性紅、喹啉黃3、赤蘚紅的萃取率均達(dá)92%以上;增加DES用量至200 μL時(shí)，莧菜紅、靛藍(lán)、喹啉黃1、喹啉黃2、誘惑紅、喹啉黃4 的萃取率均達(dá)97%;繼續(xù)增加DES用量時(shí)，11種目標(biāo)物的萃取率無(wú)明顯增大。綜上，當(dāng)DES的用量為200 μL時(shí)，11種有機(jī)合成色素(14種待測(cè)物質(zhì))的萃取率均達(dá)97%以上，故選擇DES的最佳用量為200 μL。

2.4 待測(cè)液pH值的影響

考慮到實(shí)際樣品的pH值不同，如碳酸飲料、果蔬汁飲料、葡萄酒、茶飲料、蛋白飲料等的pH值偏酸性，飲用水的pH值偏中性，因此對(duì)待測(cè)液的pH值(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)進(jìn)行了考察。采用200 μL DES分別萃取3 min后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示pH值對(duì)萃取效果的影響不大，因此不調(diào)節(jié)待測(cè)液的pH值。

2.5 渦旋時(shí)間的影響

采用200 μL DES對(duì)“1.3”中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行萃取并上機(jī)測(cè)試，考察不同渦旋時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 min)對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響。萃取率的計(jì)算如下：X=(Ai/Astdi)×100% (X為萃取率；Ai為對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取后目標(biāo)物的峰面積；Astdi為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的峰面積)。結(jié)果表明，檸檬黃、莧菜紅在渦旋時(shí)間為2 min時(shí)萃取率>98%，其余目標(biāo)物在渦旋時(shí)間為3 min時(shí)萃取率>98%，綜合考慮最終選擇最優(yōu)渦旋時(shí)間為3 min。

2.6 液相色譜條件的優(yōu)化

采用GB 5009.35-2016[6]及文獻(xiàn)[1]中的液相色譜條件對(duì)“1.3”中的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，11種目標(biāo)物無(wú)法完全出峰，存在峰重合、峰前沿的情況。由于目標(biāo)物種類多，喹啉黃還需出4個(gè)色譜峰，故將流動(dòng)相流速調(diào)整為0.8 mL/min，以保證充足的色譜出峰時(shí)間?？紤]到流動(dòng)相梯度對(duì)目標(biāo)物峰形、靈敏度的影響，對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了優(yōu)化，具體梯度見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，采用流動(dòng)相梯度a時(shí)，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液僅出10個(gè)色譜峰；采用梯度b 時(shí)出12個(gè)色譜峰；采用梯度c、d、e時(shí)，均出了13個(gè)色譜峰；當(dāng)改用梯度f(wàn)時(shí)，14種物質(zhì)均得到有效分離，且峰形尖銳，能夠滿足定性定量的要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相梯度f(wàn)。

表2 不同流動(dòng)相梯度Table 2 Gradient of different mobile phases

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 線性關(guān)系與定量下限用0.02 mol/L乙酸銨水溶液-甲醇(80∶20)將各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，其中喹啉黃1、亮藍(lán)的質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10、20、50、100 mg/L，喹啉黃2的質(zhì)量濃度分別為4.0、10、20、50、100、160 mg/L，其余物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10、20、40 mg/L，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：11種有機(jī)合成色素均線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996(見(jiàn)表3)。

向空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算定量下限(LOQ)，測(cè)得11種有機(jī)合成色素的檢出限為0.03～0.31 mg/kg，定量下限為0.08～1.02 mg/kg(見(jiàn)表3)。

2.7.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差采用碳酸飲料進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，向空白碳酸飲料樣品中添加3個(gè)水平的14種目標(biāo)物質(zhì)的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中喹啉黃1和亮藍(lán)的加標(biāo)水平為0.50、5.00、10.0 mg/kg，喹啉黃2為1.00、10.0、20.0 mg/kg，其余目標(biāo)物質(zhì)的加標(biāo)水平均為0.25、2.50、5.00 mg/kg。按照“1.4”進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。由表3可知，11種有機(jī)合成色素的回收率為92.6%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.98%～4.3%，能滿足分析要求。

表3 11種有機(jī)合成色素的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Linear relations,LODs,LOQs,recoveries and relative standard deviations of 11 organic synthetic pigments

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)購(gòu)自蘭州市超市的碳酸飲料(5份)、茶飲料(5份)、果蔬汁飲料(10份)、蛋白飲料(5份)、配制酒(5份)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定5份。結(jié)果表明，有2份碳酸飲料、1份果蔬汁飲料、2份蛋白飲料、2份配制酒檢出有機(jī)合成色素，茶飲料未檢出。按照陽(yáng)性樣品中有機(jī)合成色素的種類及含量添加相應(yīng)的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為92.4%～103%(見(jiàn)表4)。

表4 實(shí)際樣品的含量及加標(biāo)回收率Table 4 Contents and recoveries of actual samples

圖2分別為陽(yáng)性樣品(碳酸飲料2#)與11種有機(jī)合成色素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，其中喹啉黃=喹啉黃1+喹啉黃2+喹啉黃3+喹啉黃4。

2.9 與傳統(tǒng)方法的對(duì)比

將本文方法與GB 5009.35-2016[6]方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，本方法具有耗時(shí)短、試劑友好、成本低、可檢測(cè)的目標(biāo)物數(shù)量多等特點(diǎn)(見(jiàn)表5)。

表5 本文方法與傳統(tǒng)方法的對(duì)比Table 5 Comparison between the method in this paper and the traditional method

3 結(jié) 論

本文以四丁基氯化銨和辛酸為原料合成了新型的疏水性低共熔溶劑，將其作為萃取溶劑，建立了快速、高效、同時(shí)檢測(cè)飲料、配制酒樣品中11種有機(jī)合成色素的HPLC-DAD法。結(jié)果表明，11種有機(jī)合成色素的檢出限為0.03～0.31 mg/kg，定量下限為0.08～1.02 mg/kg，回收率為92.6%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98%～4.3%。本方法操作簡(jiǎn)單、回收率高、快速高效、目標(biāo)物多,可以廣泛應(yīng)用于飲料、配制酒中有機(jī)合成色素的檢測(cè)。