牙周炎大鼠正畸性牙根吸收中RANKL、TNF-α在牙周膜壓力側(cè)的表達

楊偉紅 黃生高 于樂蓉

牙根吸收是正畸治療常見并發(fā)癥之一，其生物學機制與骨吸收類似，是一種多細胞／多因子共同參與、協(xié)調(diào)作用的復雜過程［1］。破牙骨質(zhì)細胞在形態(tài)和功能上類似于破骨細胞，在牙根吸收中發(fā)揮破牙骨質(zhì)作用，溶解無機礦物質(zhì)、降解細胞外有機基質(zhì)［2］。核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是促進破骨細胞和破牙骨質(zhì)細胞分化和激活的重要因子，RANKL與破牙骨質(zhì)細胞前體表面的特異性受體RANK結(jié)合進行信號轉(zhuǎn)導，誘導破牙骨質(zhì)細胞的形成和分化［3］；TNF-α可直接或間接地促進破牙骨質(zhì)細胞分化和增殖［4］。

牙周炎是一種漸進性感染性的炎性疾病，可導致牙槽骨吸收和牙周附著喪失。在細菌或細菌產(chǎn)物刺激下牙周韌帶成纖維細胞表達的RANKL和TNF-α增加［5］，與成纖維細胞在機械力作用下的反應(yīng)類似［6］。實驗觀察伴或不伴有牙周炎大鼠正畸牙的壓力側(cè)牙根吸收情況、破牙骨質(zhì)細胞數(shù)目以及RANKL和TNF-α的表達，探究牙周炎對正畸性牙根吸收的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

兔抗RANKL抗體（23408-1-AP）、小鼠抗TNF-α抗體（60291-1-Ig，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；TRAP試劑盒（自配）；SP免疫組化試劑盒（PV9001）、DAB顯色盒（ZLI-9018，北京中山金橋）。

1.2 實驗動物及牙周炎模型建立

40只6周齡雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量（250±10）g，由中南大學實驗動物學部提供。隨機分為牙周炎組和對照組，每組20只。牙周炎組依據(jù)Nakamura-Kiyama等［7］的方法，使用3-0絲線結(jié)扎于大鼠左側(cè)上頜第一磨牙牙頸部；對照組不作絲線結(jié)扎。正常飲食飼養(yǎng)4周后2組各處死5只作為加力0 d組。

1.3 大鼠正畸牙移動

將大鼠上頜切牙作為支抗，使用鎳鈦拉簧提供持續(xù)牽引力（0.49 N）近中移動上頜第一磨牙，建立牙周炎組和對照組正畸牙移動模型，加力3、7、14 d后2組各處死5只。

1.4 組織學標本制備

取上頜標本常規(guī)固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋，沿第一磨牙近遠中方向連續(xù)切片，厚度為4μm。常規(guī)HE染色、按照試劑盒上的說明分別進行TRAP染色、RANKL和TNF-α免疫組化染色。

1.5 圖像處理

每個標本取5張切片，Winceph 8.0軟件測量上頜第一磨牙遠頰根牙根吸收面積和牙根總面積，計算牙根吸收指數(shù)（牙根吸收指數(shù)＝牙根吸收面積／牙根總面積）。TRAP和IHC染色的切片于遠頰根壓力側(cè)牙根表面隨機選取3個不重疊視野（×400）進行圖像采集。TRAP陽性染色、胞核在2個或以上且位于牙根表面的細胞計數(shù)為多核破牙骨質(zhì)細胞，其余為單核破牙骨質(zhì)細胞。IHC切片采用Image Pro Plus圖像分析軟件測量RANKL、TNF-α平均光密度。

1.6 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS23.0軟件統(tǒng)計，非參數(shù)檢驗法分析牙根吸收指數(shù)；計量資料以表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）和t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周及牙根吸收情況

加力0 d時進行牙周檢查，牙周炎組：牙齦紅腫，探診出血，探及牙周袋；對照組：牙周情況良好。X線片：與對照組相比，牙周炎組牙槽骨低平，釉質(zhì)牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂距離增加，根分叉暴露（圖1）。

加力3 d時牙根表面罕見吸收跡象，7 d時可見大量牙根吸收陷窩，14 d時牙根吸收面積增加，未見有吸收陷窩修復的表現(xiàn)（圖2）。加力7、14 d時牙周炎組牙根吸收指數(shù)顯著大于對照組（P＜0.05）（圖3）。

圖1 加力0 d大鼠正畸牙X線片檢查Fig 1 X-ray examination of orthodontic teeth in rats at day 0

圖2 2組大鼠牙根吸收的變化 （×100）Fig 2 The changes of root absorption of the rats in the 2 groups （×100）

圖3 加壓后不同時間2組大鼠牙根吸收Fig 3 Rat root absorption of the 2 groups after loading

2.2 破牙骨質(zhì)細胞數(shù)目變化

加力后破牙骨質(zhì)細胞出現(xiàn)在壓力側(cè)牙根表面，主要分布于牙根吸收陷窩周圍（圖4）。單核破牙骨質(zhì)細胞在加力3 d時最多，而多核破牙骨質(zhì)細胞在加力7 d時最多，加力7 d時牙周炎組單核和多核破牙骨質(zhì)細胞數(shù)目均高于對照組（P＜0.05）（圖5）。

2.3 RANKL、TNF-α的表達

RANKL在加力7 d時呈強陽性表達（圖6），加力3、7、14 d時牙周炎組明顯高于對照組（P＜0.05）。TNF-α在加力7 d時陽性表達最強（圖7），加力3、7、14 d時牙周炎組顯著高于對照組（P＜0.05）（表1）。

圖4 TRAP染色（×400）Fig 4 TRAP stained （×400）

圖5 加力后不同時間2組大鼠破牙骨質(zhì)細胞數(shù)目Fig 5 Rat odontoclasts number of the groups after loading

表1 不同時間牙周炎組和對照組壓力側(cè)RANKL和TNF-α平均吸光度值 （，n＝5）Tab 1 A value of RANKL and TNF-αexpression at the compressive side of the groups after loading（，n＝5）

表1 不同時間牙周炎組和對照組壓力側(cè)RANKL和TNF-α平均吸光度值 （，n＝5）Tab 1 A value of RANKL and TNF-αexpression at the compressive side of the groups after loading（，n＝5）

時間RANKL TNF-α對照組 牙周炎組 P值 對照組 牙周炎組 P值5 0.085±0.005 0.541 3 d 0.095±0.004 0.162±0.001 0.009 0.143±0.001 0.215±0.003 0.002 7 d 0.244±0.003 0.313±0.005 0.036 0.313±0.004 0.511±0.006 0.000 14 d 0.051±0.002 0.109±0.004 0.022 0.085±0.0 0 d 0.059±0.002 0.050±0.001 0.484 0.063±0.00 06 0.200±0.008 0.033

圖6 2組大鼠牙周帶中RANKL的表達 （×400）Fig 6 RANKL expression in periodontal ligament of rats of the 2 groups （×400）

圖7 2組大鼠牙周帶中TNF-α的表達 （×400）Fig 7 TNF-αexpression in periodontal ligament of rats of the 2 groups （×400）

3 討 論

正畸力作用下牙齒張力側(cè)新骨形成、壓力側(cè)發(fā)生骨吸收，從而產(chǎn)生牙移動。牙根吸收是正畸治療過程中一種不希望出現(xiàn)的情況，在壓力側(cè)牙根附近透明樣變清除過程中，覆蓋在牙根表面的成牙骨質(zhì)細胞層被破壞，從而使下方高度礦化的牙骨質(zhì)暴露［8］。除單核巨噬細胞外，無皺褶緣的多核TRAP陽性巨細胞也參與透明樣變的清除，這可能是早期尚未成熟的前破骨／破牙骨質(zhì)細胞，機械力刺激下它們很快分化為成熟的破骨／破牙骨質(zhì)細胞［9］，分別參與牙槽骨和牙根吸收過程。TRAP染色可用于標記分化后期的單核破牙骨質(zhì)細胞和成熟多核破牙骨質(zhì)細胞，能反應(yīng)牙根吸收的狀態(tài)。

骨吸收和鈣代謝主要通過RANK-RANKL-OPG軸進行調(diào)控，在正畸牙移動過程中該系統(tǒng)不僅調(diào)節(jié)牙槽骨的吸收改建，還對正畸性牙根吸收有重要的調(diào)控作用。Yamaguchi等［10］發(fā)現(xiàn)，發(fā)生嚴重牙根吸收的正畸牙壓力側(cè)牙周膜中RANKL表達上調(diào)；Low等［11］報道了在正畸力作用下發(fā)生牙根吸收的組織中檢測到RANKL的mRNA。本實驗中也觀察到RANKL在牙根吸收陷窩附近的組織中高表達。

TNF-α是一種超強炎性介質(zhì)，能夠激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，誘導破骨細胞分化和增殖。TNF-α主要通過與TNF-R1作用發(fā)揮生物活性，Zhang等［12］發(fā)現(xiàn)敲除TNF-α的受體TNFR1可顯著抑制RANK表達，減少破骨細胞分化，從而間接影響破骨細胞形成。此外，TNF-α還可以直接刺激破骨細胞形成，在Kudo等［13］的研究中，TNF-α直接作用于前破骨細胞，誘導成熟多核破骨細胞形成，此過程不被骨保護素（OPG）抑制。由于破牙骨質(zhì)細胞和破骨細胞都來源于造血細胞，二者形態(tài)功能相似，結(jié)合本實驗結(jié)果可推知，TNF-α可能誘導破牙骨質(zhì)細胞的形成。

牙周炎是口腔兩大類主要疾病之一，牙槽骨破壞是其最主要的診斷特征。牙周炎的病理改變不僅與牙周致病微生物及其毒性產(chǎn)物侵入有關(guān) ，還與機體防御應(yīng)答所產(chǎn)生的一系列因子有關(guān) ，如TNF-α［14］。TNF-α作為細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員，具有廣泛的生物學作用：作為始動因子啟動炎癥反應(yīng)；增加破骨細胞的形成和活性，促進骨吸收；增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，導致膠原纖維破壞；刺激基質(zhì)細胞凋亡，限制牙周組織修復等［15］。牙周炎中細菌產(chǎn)生的LPS使成骨細胞RANKL表達增強，活化的T細胞也可分泌大量RANKL［16］。Boas等［17］發(fā)現(xiàn)正畸力作用下牙周炎大鼠的牙周組織中TNF-α表達增加，Romer等［18］的體外實驗證實牙周病原體和正畸力的協(xié)同作用可刺激牙周韌帶細胞表達的RANKL上調(diào)。本實驗中也觀察到RANKL和TNF-α在牙周炎組的表達高于對照組。不僅如此，牙周炎組的單核和多核破牙骨質(zhì)細胞數(shù)目加力7天時明顯多于對照組，牙根吸收也更為嚴重，這可能是由于牙周炎使RANKL、TNF-α表達增加，而這些細胞因子進一步促進了破牙骨質(zhì)細胞的形成和活化，從而加重了牙根吸收這一正畸副反應(yīng)。

通過本實驗，并結(jié)合其他學者的相關(guān)研究，提示控制牙周炎癥有利于減少正畸性牙根吸收等不良反應(yīng)的發(fā)生。