急性腎損傷相關(guān)性SIRT研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治?

賈圣琪, 裴漢軍

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2016級(jí)碩士研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014060;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

AKI是一組常見(jiàn)的臨床綜合證，一般指突發(fā)(1～7 d內(nèi))和持續(xù)(>24 h)的腎功能突然下降[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，AKI可造成腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂。同時(shí)，在體和離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AKI可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)膜的呼吸鏈相關(guān)酶活性異常，以及線(xiàn)粒體通透性改變[3]。另一方面，AKI可引起線(xiàn)粒體分裂蛋白Drp1大量激活，導(dǎo)致線(xiàn)粒體分裂、片斷化、腎小管上皮細(xì)胞凋亡[4-5]。

SIRT是依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶的具有去乙酰化活性的一大類(lèi)進(jìn)化保守蛋白家族，可調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程，共有7種亞型(SIRT1～7)[6-7]。近期研究顯示，多種原因?qū)е碌哪I臟損傷會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體SIRT水平下降，其水平變化與腎功能損傷加重，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，能量代謝異常，線(xiàn)粒體的裂解融合失衡，以及細(xì)胞凋亡水平升高明顯相關(guān)。這些研究提示SIRT將成為線(xiàn)粒體靶向治療AKI的新思路[8-12]。

目前，SIRT的研究趨于火熱，而各種研究對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇又有所不同，選擇正確的動(dòng)物模型對(duì)于SIRT蛋白功能的研究至關(guān)重要。本文以上研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥龀鋈缦戮C述。

1 AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究的模型動(dòng)物選擇

如今，可用于AKI模型建立的試驗(yàn)動(dòng)物多種多樣，但實(shí)際選擇中，動(dòng)物經(jīng)濟(jì)成本、試驗(yàn)周期的控制，以及造模效果等因素都是制約試驗(yàn)動(dòng)物選擇的關(guān)鍵因素[13]。

非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物十分稀缺，數(shù)量有限，模型建立后的數(shù)據(jù)難以構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且成本高昂，造模要求高，故目前鮮有選擇；貓、狗在生理學(xué)特性以及對(duì)藥物和毒物反應(yīng)上與人類(lèi)有相似之處，但其選擇往往受到動(dòng)物保護(hù)主義及倫理問(wèn)題限制，同時(shí)造模條件嚴(yán)格，經(jīng)濟(jì)成本高，故依然選擇較少；小型豬、兔、大鼠在造模選擇中雖然較少受到動(dòng)物保護(hù)及倫理的影響，但其對(duì)腎臟損傷耐受較強(qiáng)，故試驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致造模周期延長(zhǎng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)個(gè)體的生長(zhǎng)周期久，難以在較短時(shí)間大量繁殖培育，故大量選擇會(huì)較高提升實(shí)驗(yàn)成本，因此以上三者的選擇同樣存在較多顧慮。

在眾多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，小鼠是目前世界上品種、品系最多，使用量最大且研究最為詳盡、用途最廣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其在遺傳、腫瘤、免疫等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用。同時(shí)，在生理特點(diǎn)方面具有較多優(yōu)勢(shì)。首先，小鼠生長(zhǎng)快、生長(zhǎng)周期短、成熟早，有利于繁殖生產(chǎn)；其次，個(gè)體體型較小，便于試驗(yàn)操作，模型建立要求較低；再有，小鼠的生理數(shù)據(jù)使用較為普遍，已有大量研究支持，受到長(zhǎng)期討論證實(shí)；最后，小鼠對(duì)外界刺激耐受較差，對(duì)試驗(yàn)干預(yù)更為敏感，造模效果較其他動(dòng)物有明顯優(yōu)勢(shì)。綜合考慮，小鼠飼養(yǎng)管理方便，容易達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，造模成本低、效果好，在急性腎損傷相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT改變的研究中脫穎而出，經(jīng)過(guò)多重因素的篩選，小鼠成為目前較受歡迎的試驗(yàn)動(dòng)物[14-15]。

然而，小鼠品種、品系繁多，各自的生理特點(diǎn)有所不同，選擇合適的品種、品系是試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒌年P(guān)鍵問(wèn)題。近些年來(lái)，急性腎損傷相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT改變的研究中，C57BL/6小鼠被廣泛使用。該小鼠被認(rèn)作“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系，并且已經(jīng)完成其基因序列的測(cè)定，在遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)研究中均為常用品系。在該研究的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校渖飳W(xué)特征有以下優(yōu)勢(shì)：第一，乳腺腫瘤的自然發(fā)生率低，致癌劑使用難以誘發(fā)腫瘤，故試驗(yàn)干預(yù)造成小鼠癌變可能較小，病理標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定；第二，對(duì)放射線(xiàn)耐受力中等，造模中如涉及放射干預(yù)，動(dòng)物反應(yīng)更為敏感；第三，補(bǔ)體活性高，較易誘發(fā)免疫耐受性，試驗(yàn)操作受到動(dòng)物免疫因素干擾較??；第四，因常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，故為許多突變基因提供遺傳背景，同時(shí)在試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒅?，為培育SIRT基因剔除小鼠提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，使試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆纸M對(duì)比上升到了基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)層面，嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性進(jìn)一步得到提升。綜上可知，C57BL/6小鼠的選擇對(duì)此研究更具說(shuō)服力[16-18]。

2 小鼠AKI模型的建立

AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究的基礎(chǔ)是在試驗(yàn)動(dòng)物水平建立起AKI模型，該模型的可行性、科學(xué)性缺一不可，同時(shí)又需要對(duì)研究方向做出針對(duì)性的調(diào)整。目前AKI的造模方式多種多樣，針對(duì)SIRT的研究卻很有限，因此選擇合適AKI模型就顯得至關(guān)重要。以下列舉近些年相關(guān)研究的常用AKI模型思路，以便進(jìn)一步分析思考。

2.1模型一 雙側(cè)夾閉小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型[19-20]選用C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體重20～25 g，用隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組(Control Group,C組)，假手術(shù)組(sham operated group,S組)、缺血再灌注組(Ischemia reperfusion injury Group,IR組)，其中C組4只、S組32只、IR組32只。C組：不予手術(shù)處理。S組：用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通過(guò)腹腔注射的方式麻醉小鼠，隨后取腹部正中切口切開(kāi)腹壁，暴露、游離雙側(cè)腎蒂，不進(jìn)行腎蒂夾閉操作，其余同IR組。IR組：用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通過(guò)腹腔注射的方式麻醉小鼠，隨后取腹部正中切口切開(kāi)腹壁，暴露、游離雙側(cè)腎蒂，進(jìn)而用無(wú)損傷止血夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂，腎臟由紅色變?yōu)樽仙醋C明已造成腎臟缺血，夾閉成功，進(jìn)一步夾閉持續(xù)30 min；夾閉時(shí)間結(jié)束后，打開(kāi)微動(dòng)脈止血夾恢復(fù)腎臟供血，若腎臟顏色變化為由紫黑色逐漸恢復(fù)紅色，證明再灌注成功；再灌注完成后，逐層縫合腹部創(chuàng)口。操作全程注意無(wú)菌原則，同時(shí)術(shù)中如有重要器官或大血管損傷，應(yīng)及時(shí)剔除。待S組、IR組小鼠術(shù)后清醒后，將其放回籠中，密切關(guān)注其生命體征。S組和IR組小鼠分別于再灌注0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，5 d、7 d處死采樣(4只/時(shí)間點(diǎn))。

2.2模型二 單側(cè)夾閉、對(duì)側(cè)腎切除小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型[21-22]選用24只C57BL/6小鼠，雄性，體重25～28 g，隨機(jī)將小鼠分為三個(gè)組(8只/組)：S組、IR組、干預(yù)處理+IR組。每只小鼠均通過(guò)吸入異氟烷的方式麻醉。IR組：腹部皮膚中央?yún)^(qū)域碘伏消毒，腹部正中切口剖腹，游離雙側(cè)腎蒂，左側(cè)腎門(mén)部結(jié)扎腎動(dòng)脈和輸尿管，切除左側(cè)腎臟，留取腎臟組織標(biāo)本；右側(cè)腎蒂用無(wú)損傷微動(dòng)脈止血夾夾閉(腎臟顏色由櫻桃紅轉(zhuǎn)為深紫色即為夾閉成功)，持續(xù)夾閉30 min，夾閉時(shí)間結(jié)束后，松開(kāi)止血夾恢復(fù)腎臟灌注(腎臟由深紫色恢復(fù)櫻桃紅色)；操作結(jié)束后，縫合腹部創(chuàng)口，將術(shù)后小鼠放置于保溫加熱板上，直至小鼠清醒。S組：同樣進(jìn)行麻醉、消毒、腹部切開(kāi)操作，術(shù)后保溫自然蘇醒，但不進(jìn)行左側(cè)腎切除，右側(cè)腎蒂夾閉操作。干預(yù)處理+IR組：于術(shù)前或術(shù)后對(duì)小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)操作，其余處理同IR組。各組小鼠均于腎臟再灌注后24 h處死取材(經(jīng)眼球靜脈叢取血，開(kāi)腹取腎臟組織)，進(jìn)一步送檢分析。

2.3模型三 甘油注射小鼠急性腎損傷模型[23]選用18只C57BL/6清潔級(jí)小鼠，雄性，6～8 周齡，體重18～22 g，隨機(jī)分為3組(6只/組)：C組，AKI組，干預(yù)處理+AKI組。各組小鼠均在操作前禁水12 h。C組：在小鼠雙側(cè)股肌內(nèi)側(cè)注射生理鹽水(8 ml/kg)。AKI組：將用PBS稀釋后的50 %甘油，于小鼠雙側(cè)股肌內(nèi)側(cè)注射，劑量為8 ml/kg。干預(yù)處理+AKI組：甘油注射同AKI組，造模6 h后，進(jìn)行干預(yù)處理，于小鼠尾靜脈注射藥物或生物制劑200 μL。實(shí)驗(yàn)階段全程對(duì)小鼠進(jìn)行分籠清潔級(jí)動(dòng)物喂養(yǎng)，室溫保持在20℃左右，相對(duì)濕度為40 %～60 %。操作結(jié)束3 d后，處死全部小鼠，并取血及雙側(cè)腎臟進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)分析。

2.4模型四 結(jié)扎盲腸小鼠急性腎損傷模型[24]選用30只C57BL/6小鼠，雄性，6～8 周齡，體重20～25 g。用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為3個(gè)組(10只/組)：膿毒癥組(cecum ligation and puncture,CLP組)、膿毒癥+干預(yù)組、S組。首先對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，采用2 %戊巴比妥鈉(80mg/kg)，腹腔內(nèi)注射,待小鼠麻醉至合適的麻醉深度后，取仰臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)，進(jìn)一步備皮消毒腹正中部手術(shù)區(qū)域，隨后進(jìn)行各組操作。CLP組：于小鼠腹正中線(xiàn)剖腹切開(kāi)，切口約1.5 cm，用鑷子游離小鼠的盲腸和腸系膜，進(jìn)而于回盲部一下位置用無(wú)菌絲線(xiàn)(4號(hào))環(huán)形結(jié)扎盲腸，然后用針頭(20號(hào))于盲腸末端部位進(jìn)行穿刺，嘗試可以擠出糞便即可，接著將盲腸及腹腔內(nèi)組織還納腹腔，逐層進(jìn)行縫合關(guān)腹；術(shù)后將1 ml生理鹽水注入小鼠背部皮下，行體液復(fù)蘇，術(shù)后自由進(jìn)食水。膿毒癥+干預(yù)組：盲腸結(jié)扎及穿刺等造模步驟同CLP組，于造模1 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，行藥物或生物制劑干預(yù)處理。S組：余操作同膿毒癥+干預(yù)組，但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔，操作后腹腔內(nèi)注射藥物替換為等量生理鹽水。三組小鼠均于操作完成后24 h進(jìn)行適量麻醉(方法同前)，隨后處死取材：經(jīng)一側(cè)眼球取全血，量約7 00～1 000 μL，隨后進(jìn)一步送檢；沿小鼠腹正中線(xiàn)切開(kāi)腹腔，分離暴露主動(dòng)脈以及雙側(cè)腎蒂，采取腎切除術(shù)，取雙側(cè)腎組織進(jìn)一步檢驗(yàn)。

2.5模型五 順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型[25]選用18只C57BL/6清潔級(jí)小鼠，雄性，周齡8周左右，體重22～25 g。隨機(jī)將小鼠分為3組，每組各6只：順鉑10 mg/kg組，順鉑20 mg/kg組，C組。操作前，將順鉑以1 g/L溶于生理鹽水中。順鉑10 mg/kg組：將順鉑以10 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。順鉑20 mg/kg組：將順鉑以20 mg/kg的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。C組：將生理鹽水替代順鉑進(jìn)行注射，劑量為每10g體重單次腹腔注射0.9 %生理鹽水0.2 mL。三組小鼠均于注射藥物72 h后處死，留取血液、尿液標(biāo)本，同時(shí)切開(kāi)腹腔游離腎臟，留取腎組織標(biāo)本，進(jìn)一步送檢。

3 小鼠AKI模型的分析與選擇

以上5種模型為近些年來(lái)AKI相關(guān)研究的常用模型，每組模型都有各自的優(yōu)勢(shì)與不足。其中雙側(cè)夾閉缺血再灌注模型省去了單側(cè)腎切除術(shù)，降低了術(shù)中意外損傷、出血的風(fēng)險(xiǎn)，術(shù)后小鼠恢復(fù)好，存活率高，相對(duì)于其他侵入性操作模型更為簡(jiǎn)單且成功率高，從而降低了模型成本，但是該模型小鼠的代償能力較強(qiáng)，術(shù)后腎功能恢復(fù)較快，腎功能損傷相關(guān)生化指標(biāo)變化趨勢(shì)欠明顯；單側(cè)夾閉、對(duì)側(cè)腎切除小鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，降低了小鼠的腎功能代償能力，術(shù)后腎功能損傷較明顯，相關(guān)生化指標(biāo)損傷趨勢(shì)明顯，但對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作要求更高，小鼠容易在造模過(guò)程中意外死亡，術(shù)后存活率較低，故在一定程度上降低了造模成功率，增加了試驗(yàn)成本；甘油注射小鼠急性腎損傷模型，利用了甘油注射后橫紋肌溶解進(jìn)而導(dǎo)致AKI的原理，操作簡(jiǎn)單，小鼠對(duì)操作反應(yīng)較小，且避免了麻醉死亡的風(fēng)險(xiǎn)，但該操作對(duì)藥物準(zhǔn)備要求相對(duì)較高，須保證藥物濃度調(diào)配無(wú)誤，劑量精確，同時(shí)應(yīng)熟練掌握操作中的注射方法，如研究?jī)?nèi)容受甘油注射干擾需選擇其他模型；結(jié)扎盲腸小鼠急性腎損傷模型，針對(duì)膿毒癥造成的AKI研究有針對(duì)性意義，由于解剖結(jié)構(gòu)原因，造模中導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p傷的可能性較小，術(shù)后恢復(fù)較好，但該模型的對(duì)操作者解剖基礎(chǔ)要求較高，操作相對(duì)繁瑣，且術(shù)后由于小鼠個(gè)體差異，以及對(duì)感染的耐受不同，模型效果相對(duì)不穩(wěn)定，如研究?jī)?nèi)容受感染因素干擾，應(yīng)考慮選擇其他模型方法；順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型，操作簡(jiǎn)單，操作后AKI效果明顯，避免了麻醉，侵入性操作的風(fēng)險(xiǎn)，但該模型的藥物成本更高，同時(shí)要求操作者對(duì)化療藥物的特點(diǎn)及計(jì)量調(diào)整熟練掌握，如化療藥物的使用對(duì)研究?jī)?nèi)容存在干擾應(yīng)考慮其他模型方法。

4 AKI相關(guān)性線(xiàn)粒體SIRT研究中動(dòng)物模型的思考與展望

SIRT作為一種對(duì)于細(xì)胞應(yīng)激、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程具有保護(hù)及調(diào)節(jié)作用的蛋白，以每種模型作為基礎(chǔ)進(jìn)行研究均有其價(jià)值所在。造影劑腎病(Contrast-induced acute kidney injury, CI-AKI)、糖尿病腎病、橫紋肌溶解癥相關(guān)性急性腎損傷、膿毒癥急性腎損傷以及順鉑急性腎損傷均是臨床中棘手的難題，以上模型可在一定程度上模擬相關(guān)臨床疾病的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而在此模型基礎(chǔ)上的SIRT的研究將進(jìn)一步明確SIRT在各類(lèi)疾病中的影響與相關(guān)機(jī)制，對(duì)各類(lèi)疾病導(dǎo)致的AKI提供線(xiàn)粒體靶向治療的可能性。

近些年來(lái)，隨著冠心病患者從冠脈介入中的臨床獲益程度日益增加，介入治療的相關(guān)并發(fā)癥也逐漸凸顯，其中CI-AKI是臨床中較為常見(jiàn)的問(wèn)題。CI-AKI的基本病理生理過(guò)程是急性腎小管上皮細(xì)胞缺血，以缺血再灌注損傷為基礎(chǔ)的小鼠的AKI模型可較好的模擬CI-AKI，這使得與CI-AKI密切相關(guān)的“腎臟缺血對(duì)線(xiàn)粒體特異性SIRT 的影響及機(jī)制研究”更為可行。該研究具有深刻的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)今后臨床中CI-AKI的防治思路提供了新的契機(jī)，值得我們?cè)诮窈蟮膶W(xué)習(xí)中進(jìn)一步關(guān)注。