上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)生物標(biāo)志物在大腸癌中的研究進(jìn)展*

孫紅梅，武金寶

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2016級(jí)碩士研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所)

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上常見的惡性腫瘤，分為結(jié)腸癌和直腸癌，是多基因、多因素、多步驟的復(fù)雜的過(guò)程，是當(dāng)下嚴(yán)重影響人類健康的惡性腫瘤之一。癌癥統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在惡性腫瘤發(fā)病率中結(jié)直腸癌居第3位，死亡率居第4位[1]。大腸癌的5年生存率仍然不是很高，50 %以下[2]?？v然近些年大腸癌的早期診斷方法有了提高和進(jìn)步，可是因?yàn)榇竽c癌早期臨床癥狀如排便習(xí)慣的改變與糞便性狀的改變相對(duì)比較隱匿，得不到患者的充分重視，容易受到患者忽視，如若出現(xiàn)腸梗阻等明顯癥狀時(shí)，才會(huì)引起患者的注意，這時(shí)來(lái)醫(yī)院就診一般是結(jié)腸癌中晚期，這也是其死亡率居高不下的緣由之一。大腸癌的治療主要以手術(shù)治療為主，聯(lián)合放化療，以及最近新興的靶向治療、基因治療及免疫治療等。但是，術(shù)后的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍然不能得到滿意的控制，仍是大腸癌患者死亡的主要原因。因此，尋找有效的治療方法是刻不容緩的，靶向治療是目前研究的熱點(diǎn)，想要尋找有效的靶向藥物，就必須要對(duì)大腸癌發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入的透徹的研究，并且還可以對(duì)具有共同機(jī)械特性的其他癌癥的診治提供參考。近年來(lái)的學(xué)術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT)在大腸癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到舉足輕重的作用。我們是否可以通過(guò)對(duì)EMT的深入研究，尋找到有效的治療方法。

1982 年，Greenburg 和Hay首次提出了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT)概念，他們?cè)谘芯烤w狀上皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，這種上皮細(xì)胞可以在膠原凝膠培養(yǎng)基中形成擁有偽足的間質(zhì)細(xì)胞[3]。EMT在生理過(guò)程和病理性反應(yīng)中均表現(xiàn)出重要作用[4]。EMT是指在特定的情況下，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，此轉(zhuǎn)化過(guò)程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的極性喪失，丟失細(xì)胞間的緊密連接和粘附連接，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，從而獲得更強(qiáng)的細(xì)胞遷移、侵襲、增殖及抗凋亡能力[5]，同時(shí)，細(xì)胞表型發(fā)生改變，上皮表型，如：E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-連環(huán)蛋白(α-catenin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細(xì)胞角蛋白、粘蛋白、橋粒蛋白等逐漸喪失，而獲得間質(zhì)表型，如波形蛋白(vimentin)、纖連蛋白、神經(jīng)型鈣粘蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-3、MMP-9等的表達(dá)增加[6]。故就近幾年來(lái)關(guān)于EMT相關(guān)的生物標(biāo)志物,如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、波形蛋白(vimentin)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transfrming Growth Factor β1)、P21活化激酶(p21-activated kinases 1，PAK1)等在大腸癌中的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 E-cadherin

1.1E-cadherin 的結(jié)構(gòu) E-cadherin基因位于16號(hào)染色體q22.1 ,是一個(gè)至關(guān)重要的抑癌基因,在1995 年由 Berx 首先克隆[7]。人源性 E-cadherin 由CDH1 基因編碼，是迄今研究最多的鈣黏蛋白家族成員。E-cadherin的分子量為124KD ，約由720 -750左右的氨基酸構(gòu)成的，一類廣泛地存在于各種上皮源組織中的依托于鈣離子的跨膜糖蛋白，包括N 端的胞外區(qū)、C 端的胞內(nèi)區(qū)及高度疏水的跨膜區(qū)。胞外區(qū)是鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)，E-cadherin分子之間通過(guò)胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域相互形成鏈接;胞內(nèi)區(qū)能與 β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、α-連環(huán)蛋白(α-catenin)結(jié)合形成復(fù)合體，后者直接與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白連接，用以維持上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間粘附的穩(wěn)定性[8]。E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附系統(tǒng)的失調(diào)涉及到許多癌癥的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展，包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等等[9-11]。

1.2E-cadherin 與大腸癌 研究表明，在大腸癌惡性進(jìn)展中，E-cadherin會(huì)出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)或完全丟失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞之間粘附力下降，這會(huì)使腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的能力增加，因此腫瘤的惡性程度增高，預(yù)后變差[12]。E-cadherin 表達(dá)下調(diào)被認(rèn)為是EMT 的標(biāo)志性事件[13]。E-cadherin 表達(dá)的降低可由基因突變、啟動(dòng)子甲基化、染色質(zhì)重構(gòu)、下游轉(zhuǎn)錄因子的修飾以及轉(zhuǎn)錄抑制引起[14-16]。Palaghia等[17]收集CRC結(jié)腸切除術(shù)的65例患者，采用免疫組化的方法進(jìn)行比較原發(fā)性CRC和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的E-鈣粘蛋白表達(dá)與正常結(jié)腸粘膜和正常淋巴結(jié)表現(xiàn)的表達(dá)的差異，結(jié)果顯示，與正常結(jié)腸粘膜相比，原發(fā)性CRC表現(xiàn)出較高的異常E-鈣粘蛋白表達(dá)率(P<0.001)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)E-cadherin在良好和中分化的CRC中比低分化中呈現(xiàn)出顯著的高表達(dá)，這也就進(jìn)一步說(shuō)明了E-鈣粘蛋白是腫瘤侵襲性和擴(kuò)散潛力的重要標(biāo)志。同樣，在我國(guó)的研究學(xué)者如顧國(guó)利等研究[18]主要是應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)60例大腸癌腫瘤組織標(biāo)本和8例正常組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)E-cadherin 在大腸癌組的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于正常組，并發(fā)現(xiàn)E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率與侵犯深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這說(shuō)明了E-cadherin的表達(dá)異常不僅與大腸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)與大腸癌的早期發(fā)生相關(guān)。隋立榮等[19]通過(guò)應(yīng)用組織芯片，采用免疫組化法的檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果提示大腸癌組織內(nèi) E - cadherin的表達(dá)與正常黏膜上皮有顯著差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多,E -cadherin的表達(dá)越差；TNM分期越高，E -cadherin的表達(dá)越差；并且發(fā)現(xiàn)與癌組織的分化程度有顯著差異，E - cadherin的表達(dá)隨著腫瘤分化程度的降低而下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能說(shuō)明E-cadherin的異常表達(dá)不僅與CRC的發(fā)生有關(guān)，還與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2 β-catenin

2.1β-catenin的結(jié)構(gòu) β-catenin 基因定位于染色體3p21.3，全長(zhǎng)23.2 kb，共有16 個(gè)外顯子，其 m RNA長(zhǎng)度為3362 個(gè)核苷酸殘基。β-catenin 基因編碼產(chǎn)物為β-catenin 蛋白，是 Wnt 經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵因子，在大腸癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用[20,21]。β-catenin具有雙重調(diào)節(jié)功能并且能夠獨(dú)立發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。β-catenin主要有兩個(gè)功能，其中一個(gè)作用就是它作為一種重要的細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架成分，β-catenin與E-cadherin結(jié)合成E-cadherin/β-catenin復(fù)合體，該復(fù)合體均勻分布于細(xì)胞膜上，參與同種細(xì)胞間粘附的調(diào)節(jié)[22]。另一作用就是參與Wnt 經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)[23]。細(xì)胞漿內(nèi)的β-catenin與APC、GSK-3β及Axin 蛋白結(jié)合形成多蛋白復(fù)合體,通過(guò)GSK-3β磷酸化與去磷酸化的過(guò)程來(lái)降解β-catenin，因而致細(xì)胞漿內(nèi)游離的β-catenin的水平極低, 不能夠移位至細(xì)胞核去調(diào)控相應(yīng)靶基因表達(dá)，但是當(dāng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開啟時(shí)，胞漿內(nèi)游離的β-catenin積累增多, 游離的β-catenin與 Tcf-4結(jié)合形成復(fù)合物, 啟動(dòng)負(fù)責(zé)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖的基因異常表達(dá), 從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[24～26]。 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化涉及幾種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但是Wnt 經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路是EMT過(guò)程中的主要通路之一。Wnt 經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路主要包括：細(xì)胞外因子(Wnt)、跨膜受體Frizzled(Frz)、β-catenin 蛋白(β-catenin)及T細(xì)胞趨化因子(TCF)等一系列蛋白。有研究表明，E-cadherin/β-catenin復(fù)合體在建立細(xì)胞極性、細(xì)胞間黏附的穩(wěn)定性、維持組織形態(tài)等方面擁有至關(guān)重要的地位，然而，當(dāng)出現(xiàn)某些因素造成E-cadherin/β-catenin復(fù)合體減少后缺如后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力降低，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，固然就易于造成侵襲以及轉(zhuǎn)移[27,28]。

2.2β-catenin與大腸癌 戈銳等[29]實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腸癌組中β-catenin膜表達(dá)缺失、β-catenin異位表達(dá)、Cox-2和MMP-7陽(yáng)性表達(dá)較正常大腸黏膜組顯著增高(P<0.05)，并同時(shí)發(fā)現(xiàn)大腸癌中 β-catenin的異位表達(dá)只與大腸癌的Dukes分期呈正相關(guān)關(guān)系。β-catenin與大腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多作者報(bào)道Wnt /β-catenin信號(hào)在CRC的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用;然而，由于Wnt信號(hào)通路的復(fù)雜性，尚不清楚哪種Wnt配體亞型影響CRC的進(jìn)展[30,31]。Yoshida N等[32]分析了201例接受CRC治愈性手術(shù)的患者，采用免疫組化的方法檢測(cè)Wnt和β-catenin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示出，在多變量分析中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.046)和核β-連環(huán)蛋白的高表達(dá)(P=0.04)是存活的獨(dú)立預(yù)后因素，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示W(wǎng)nt1可能是β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的主要激活劑，并且Wnt5a可穩(wěn)定粘附連接，從而抑制上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Emons G等[33]通過(guò)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)的異常激活不僅調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展和進(jìn)展，而且還介導(dǎo)直腸癌對(duì)化學(xué)放射療法的抗性。

3 Vimentin

3.1Vimentin的結(jié)構(gòu) 人波形蛋白(Vimentin)由位于染色體10p13上的單拷貝基因編碼的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白[34]。Vimentin存在于間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其功能是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織完整性。研究顯示，vimentin作為惡性腫瘤和EMT的標(biāo)志物，在間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞顯示陽(yáng)性，在上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞則顯示陰性[35]。因此，上皮細(xì)胞出現(xiàn)vimentin表達(dá)提示惡性腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)化[36]。Vimentin過(guò)度表達(dá)見于乳腺癌[37]、肺癌[38]、胰腺癌[39]、胃癌[40]、結(jié)直腸癌[41]、宮頸癌[42]，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌[43]等等。

3.2Vimentin與大腸癌 國(guó)外的研究學(xué)者[41]進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，波形蛋白陽(yáng)性的SW480結(jié)腸癌和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的體外侵襲性最高，并且通過(guò)RNA干擾降低波形蛋白的表達(dá)后抑制了結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞系的遷移和侵襲。劉海麗[44]對(duì)91 例大腸癌組織(實(shí)驗(yàn)組)和32 例癌旁組織(對(duì)照組)應(yīng)用免疫組化方法對(duì)E-cadherin 及Vimentin進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，可以看出，Vimentin的表達(dá)與 E-cadherin 表達(dá)相反。在結(jié)直腸癌中，波形蛋白基因甲基化最近引起了很多關(guān)注，并且有望在晚期結(jié)直腸癌中頻繁發(fā)生[45]?？梢岳眠@種現(xiàn)象來(lái)開發(fā)高靈敏度技術(shù)來(lái)檢測(cè)包括血清和糞便在內(nèi)的臨床樣品中波形蛋白基因的甲基化[46-48]。

4 TGF-β1

4.1TGF-β1的結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transfrming Growth Factor β1) 是一種由多種細(xì)胞分泌的多肽類細(xì)胞因子，并且具有多種生物學(xué)效應(yīng)。目前對(duì)TGF-β1的研究最為廣泛[49]。 TGF-β1引起的EMT是通過(guò)與其特異性受體TGF-βR結(jié)合后啟動(dòng)下游的SMAD分子來(lái)完成的[50]。TGF-β1還可以通過(guò)非SMAD分子信號(hào)途徑激活NF-κB、STAT3，將細(xì)胞膜表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核。TGF-β1增高后可磷酸化β-catenin酪氨酸殘基,導(dǎo)致E-cadherin/β-catenin(E-鈣粘蛋白/β-鈣粘素相關(guān)蛋白)復(fù)合體分離,游離的β-catenin在細(xì)胞漿內(nèi)積累增加，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)靶基因表達(dá),激活Wnt信號(hào)通路。

4.2TGF-β1與大腸癌 劉宇[51]應(yīng)用TGF-β1進(jìn)行處理SW620細(xì)胞，通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)Vimentin、Ecadherin蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：上皮標(biāo)志物E-cadherin 蛋白發(fā)生表達(dá)下降、間質(zhì)標(biāo)志物 Vimentin 蛋白發(fā)生表達(dá)升高，說(shuō)明SW620 細(xì)胞 EMT的發(fā)生。充分證明了TGF-β1可以誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。Langenski?ld M等[52]納入了169例接受結(jié)腸直腸癌手術(shù)的患者,進(jìn)行檢測(cè)大腸癌組織、距離大腸癌組織10cm的無(wú)腫瘤腸組織(正常腸粘膜)以及患者血漿中TGF-b1活性和總TGF-b1的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與宏觀無(wú)腫瘤組織相比，腫瘤組織中總TGF-b1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.0001)，腫瘤中TGF-b1蛋白的表達(dá)隨著T期的增加而增加(P=0.0006)，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病患者與沒有轉(zhuǎn)移性疾病的患者相比，腫瘤組織(P=0.004)和血漿(P=0.001)中TGF-b1蛋白表達(dá)均升高。另一個(gè)有趣的實(shí)驗(yàn)，熊斌等[53]應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)98例大腸癌組織中TGF-β1、VEGF的表達(dá)和MVD的值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期有關(guān)，與VEGF的表達(dá)、MVD呈明顯正相關(guān)。這說(shuō)明TGF-β1與大腸癌血管生成有密切關(guān)系，可能直接促進(jìn)血管的生成或通過(guò)VEGF間接促進(jìn)血管的生成，但具體機(jī)制尚不明確。

5 PAK1

5.1PAK1的結(jié)構(gòu) PAK1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸化激酶家族的成員[54]，即p21小GTP酶活化激酶1，是小G蛋白R(shí)ho家族的下游靶蛋白。根據(jù)它們結(jié)構(gòu)特性及調(diào)節(jié)機(jī)制的不同,可分成：Ⅰ類(PAK1、PAK2、PAK3)，Ⅱ類(PAK4、PAK5、PAK6)[55]。Ⅰ類與Rho家族GTPase成員如Cdc42/Rac1等結(jié)合后被活化而具有激酶活性，而Ⅱ類雖然能與之結(jié)合但不能被活化[56]。PAK1是PAK家族中第一個(gè)被鑒定出來(lái)且研究最多的分子。PAK1與細(xì)胞的分裂、凋亡、人類的多種惡性腫瘤密切相關(guān)，例如：乳腺癌、肺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等[57-60]。己知PAKs表達(dá)均受生長(zhǎng)因子的上調(diào),特別是PAK1的表達(dá)受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β的上調(diào)。由于TGF-β調(diào)節(jié)上皮一間充質(zhì)(EMT)的轉(zhuǎn)換,而PAK1調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的粘附,延展和細(xì)胞遷移性并被TGF-β調(diào)節(jié),提示PAK1在調(diào)節(jié)EMT的過(guò)程中起重要作用。

5.2PAK1與大腸癌 武金寶[61]進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)提示PAK1在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。Carter JH等[62]通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)來(lái)自38名患者的184個(gè)總標(biāo)本包含了正常人結(jié)腸組織，腺瘤，浸潤(rùn)性癌(I-III / IV期)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，實(shí)驗(yàn)提示與正常結(jié)腸相比，在腺瘤，侵襲性癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中PAK-1表達(dá)顯著增加(P<0.0001)，并且還發(fā)現(xiàn)Pak-1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)顯著高于浸潤(rùn)性癌，腺瘤或正常結(jié)腸(P<0.0001)。Gui Z等[63]進(jìn)行的體外激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PAK1能夠特異地直接磷酸化β-catenin S675 位點(diǎn)來(lái)參與信號(hào)傳遞，也就是說(shuō)，PAK1參與Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

6 小結(jié)與展望

EMT被認(rèn)為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移各種惡性腫瘤的關(guān)鍵過(guò)程，如乳腺癌[64]、結(jié)腸直腸癌[65]、前列腺癌[66]和肺癌[67。此外，EMT與細(xì)胞凋亡、放射抗性、化療耐藥性、干性和預(yù)后不良有關(guān)[68,69]。雖然目前取得眾多進(jìn)展，但是還是有一些問題處于起始階段，例如EMT的相關(guān)信號(hào)通路及分子機(jī)制尚處于探索階段，相關(guān)的研究結(jié)果將會(huì)為臨床上治療腫瘤提供重要的靶點(diǎn)，為新的靶向藥物的研究提供新思路。雖然，目前對(duì)EMT的相關(guān)研究還不是很深入，但隨著時(shí)間的發(fā)展及廣大學(xué)者對(duì)此的重視，相關(guān)的研究必將不斷深入，人類對(duì)EMT的相關(guān)機(jī)制的了解也會(huì)越來(lái)越明白，為大腸癌的新藥提出重要的指導(dǎo)意見。