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    長鏈非編碼RNACBR3-AS1在乳腺癌中的表達(dá)及其功能

    2019-12-04 00:54:54熊雄焉正慶張愛軍
    中國普通外科雜志 2019年11期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系生存率試劑盒

    熊雄,焉正慶,張愛軍

    (湖北省武漢市武昌醫(yī)院 普通外科,湖北 武漢 430061)

    乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤,為女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因,盡管癌癥診斷和治療取得一定進(jìn)展,發(fā)展中國家發(fā)病率仍在增加,迫切需要進(jìn)一步探索乳腺癌發(fā)病機(jī)制并尋找用于乳腺癌檢測和治療的新靶標(biāo)[1]。乳腺癌進(jìn)展是一個(gè)與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)的復(fù)雜多步驟過程[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子,參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和周期控制、細(xì)胞發(fā)育和分化等過程[3]。lncRNA失調(diào)與包括癌癥在內(nèi)的人類許多疾病密切相關(guān)[4-5]。lncRNA RNA CBR3(CBR3-AS1)最早發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中上調(diào)表達(dá)并調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[6]。盡管如此,CBR3-AS1在乳腺癌中作用和功能尚未完全闡明。本研究旨在探討乳腺癌組織中CBR3-AS1表達(dá)狀態(tài),其與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系和預(yù)后價(jià)值,并探討其對乳腺癌細(xì)胞功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、MDA-MB-453和SKBR3)和正常乳腺上皮細(xì)胞系(HS578Bst)購自美國ATCC細(xì)胞庫。Eagle培養(yǎng)基購自GIBCO公司,TRIzol 和SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自Invitrogen公司,qRT-PCR試劑盒(RR420)購自日本Takara公司;Transwell小室、基質(zhì)膠Matrigel購至美國BD公司;ThermoND2000C超微量分光光度計(jì)(Thermo)、GeneAmp PCR system 9700擴(kuò)增儀(PerkinElmer)、LightCycler?480 II System(Roche)。CBR3-AS1干擾序列、陰性對照序列及CBR3-AS1模擬物序列均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。LipofectamineTM2000購買自美國Invitrogen 公司。凋亡檢測試劑盒購買自Sigma公司。

    1.2 乳腺癌組織標(biāo)本

    收集我院2013年1月—2015年1月間于我院普外科行乳腺癌切除術(shù)的患者組織標(biāo)本70例,收集患者癌組織標(biāo)本和對應(yīng)癌旁組織,從臨床病歷中收集患者全部臨床資料,所有患者均經(jīng)過病理標(biāo)本確定為原發(fā)性乳腺癌并根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行乳腺癌病理診斷分類。納入標(biāo)準(zhǔn):⑴病理診斷為乳腺癌且不存在其他部位腫瘤;⑵患者手術(shù)前未接受放化療或生物治療;⑶患者存在完整的病歷和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn):⑴患者存在乳腺癌外其他部位原發(fā)性腫瘤;⑵不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.3 患者隨訪

    患者無瘤生存時(shí)間為手術(shù)后出院第1天到腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間;總生存時(shí)間為手術(shù)后出院第1天到死亡時(shí)間或隨訪截止時(shí)間,采用門診或電話方式隨訪,毎半年隨訪1次,行乳腺彩超、鉬靶或CT檢查,隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)及死亡情況。隨訪截止時(shí)間為2019年3月1日,有4例失訪。

    1.4 細(xì)胞分組及處理

    參照文獻(xiàn)方法[8]進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,將乳腺細(xì)胞SKBR3在六孔板上生長至匯合到80%以上時(shí)采用LipofectamineTM2000按照制造商說明分別轉(zhuǎn)染CBR3-AS1干擾序列(干擾組)、CBR3-AS1模擬物序列(過表達(dá)組)、陰性對照序列(陰性對照組),轉(zhuǎn)染后48 h收獲細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測以確定轉(zhuǎn)染效率。所有細(xì)胞系在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為Eagle培養(yǎng)基,取對數(shù)生長期且生長良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.5 細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡檢測

    使用MTT細(xì)胞增殖/活力測定試劑盒(Sigma,Germany)根據(jù)指南進(jìn)行細(xì)胞活力測定。測量并記錄每個(gè)孔的吸光度(570 nm),細(xì)胞活力計(jì)算公式=(OD樣本/OD對照)×100。根據(jù)制造商方案,使用膜聯(lián)蛋白-V-Fluos(Annexin-V-Fluos)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測試劑盒通過流式細(xì)胞儀評估細(xì)胞凋亡率。

    1.6 qRT-PCR檢測

    使用TRIzol從腫瘤標(biāo)本或細(xì)胞系中提取總RNA,并使用SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒根據(jù)制造商說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒在ABI-7500平臺(Applied Biosystems,USA)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增,GAPDH作為內(nèi)參。CBR3-AS1引物序列,正向:5'-CAG TGG GGA ACT CTG ACT CG-3',反向:5'-GTG CCT GGT GCT CTC TTAC C-3'。GAPDH引物序列,正向:5'-GTC AAC GGA TTT GGT CTG TAT T-3',反向,5'-AGT CTT CTG GGT GGC AGT GAT-3'。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 CBR3-AS1在乳腺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)

    CBR3-AS1在乳腺癌組織中相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織[(5.6±1.8)vs.(1.8±0.5),P<0.01]。正常乳腺上皮細(xì)胞系HS578Bst的CBR3-AS1相對表達(dá)量為2.03±0.42,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-453和SKBR3中CBR3-AS1相對表達(dá)量分別為6.5±0.8、8.3±0.7、11.9±1.2,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-453和SKBR3中CBR3-AS1相對表達(dá)量均明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞系HS578Bst(均P<0.01)(圖1)。

    圖1 qRT-PCR檢測CBR3-AS1的表達(dá) A:乳腺癌組織與癌旁組織;B:正常乳腺上皮細(xì)胞系與不同的乳腺癌細(xì)胞系Figure1 Determination of CBR3-AS1 expressions by qRT-PCR A:Breast cancer tissues and tumor adjacent tissues;B:Normal mammary epithelial cells and different breast cancer cells

    2.2 CBR3-AS1表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

    依據(jù)乳腺癌患者癌組織中CBR3-AS1的表達(dá)中位值,將患者分為CBR3-AS1高表達(dá)組(43例)和CBR3-AS1低表達(dá)組(27例)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,乳腺癌CBR3-AS1表達(dá)與年齡(P=0.546)、腫瘤大?。≒=0.478)和組織學(xué)類型(P=0.145)無關(guān),但與TNM分期(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.047)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.024)有關(guān)(表2)。

    2.3 CBR3-AS1高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

    Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,CBR3-AS1高表達(dá)組3年無瘤生存率和總生存率分別為53.3%和62.8%,CBR3-AS1低表達(dá)組3年無瘤生存率和總生存率分別為70.7%和78.4%,CBR3-AS1高表達(dá)組3年無瘤生存率(P=0.0032)和總生存率(P=0.0057)均明顯低于CBR3-AS1低表達(dá)組(圖2)。

    圖2 不同CBR3-AS1表達(dá)狀態(tài)乳腺癌患者的生存曲線 A:無瘤生存曲線;B:總生存曲線Figure2 Survival curves of breast cancer patients witn different CBR3-AS1 expression levels A:Disease-free survival curves;B:Overall survival curves

    表2 CBR3-AS1表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系[n(%)]Table2 Relations of CBR3-AS1 expression with clinical variables of the breast cancer patients [n (%)]

    2.4 轉(zhuǎn)染效率檢測

    轉(zhuǎn)染后24 h,陰性對照組CBR3-AS1相對表達(dá)量為20.4±2.5,干擾組為2.4±0.3,過表達(dá)組為54.3±4.7,過表達(dá)組CBR3-AS1相對表達(dá)量顯著高于陰性對照組(P<0.01);干擾組CBR3-AS1相對表達(dá)量明顯低于陰性對照組(P<0.01)(圖3)。

    2.5 CBR3-AS1對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

    轉(zhuǎn)染后24、48及72 h,細(xì)胞活力檢測示,過表達(dá)組細(xì)胞增殖活力明顯高于陰性對照組(P<0.01);干擾組細(xì)胞增殖活力明顯低于陰性對照組(P<0.01)(圖4)。

    2.6 CBR3-AS1對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

    陰性對照組細(xì)胞凋亡率為(19.3±1.8)%,干擾組為(53.4±3.2)%,過表達(dá)組為(15.2±1.1)%,過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯低于陰性對照組(P<0.01);干擾組細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對照組(P<0.01)(圖5)。

    圖3 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率Figure3 Transfection efficiency determination by qRT-PCR

    圖4 CBR3-AS1對乳腺癌細(xì)胞增殖活力的影響Figure4 Influence CBR3-AS1on proliferative viability in breast cancer cells

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Figure5 Cell apoptosis measured by flow cytometry

    3 討 論

    乳腺癌是發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮的惡性腫瘤,是世界范圍內(nèi)女性常見的腫瘤。2012年,全球乳腺癌新發(fā)病例170萬例,占所有女性新發(fā)癌癥的25%,死亡病例52.2萬例,占所有女性死亡病例的15%[9-11]。深入研究乳腺癌發(fā)病分子機(jī)制對尋找乳腺癌新治療方法和指導(dǎo)預(yù)后尤為重要[12-14]。

    人類基因組測序顯示約98%的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不編碼蛋白質(zhì)[15]。lncRNAs是一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼基因,其涉及細(xì)胞發(fā)育和分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯及代謝調(diào)節(jié)[16]。越來越多的證據(jù)表明lncRNA可作為致癌或腫瘤抑制基因參與多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展[17-19]。人乳腺癌中l(wèi)ncRNA的微陣列表達(dá)譜分析顯示,乳腺癌組織及配對的鄰近組織中存在790個(gè)上調(diào)和637個(gè)下調(diào)lncRNA[20]。多種lncRNA如POU3F3、MT1DP、HOTAIR和PRNCR1在人類癌癥中發(fā)揮致癌或抑癌特性[5]。CBR3-AS1,也稱為PlncRNA-1,是21號染色體上的蛋白質(zhì)編碼基因,位于羰基還原酶3(CBR3)的反義區(qū)域。先前研究[8,21-22]表明CBR3-AS1在前列腺癌和食道癌的癌組織中過度表達(dá)且體外調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖。在骨肉瘤[23]中,CBR3-AS1在癌組織中上調(diào)表達(dá),并與Enneking分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級相關(guān),CBR3-AS1高表達(dá)與骨肉瘤預(yù)后不良相關(guān),敲低CBR3-AS1表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,并促進(jìn)凋亡。呂波等[24]報(bào)道lncRNA CBR3-AS1在膽管細(xì)胞癌表達(dá)升高,升高的lncRNA CBR3-AS1與膽管細(xì)胞癌的惡性臨床病理特征及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在本研究報(bào)道了與相應(yīng)的癌旁組織和細(xì)胞系比,CBR3-AS1在乳腺癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào),CBR3-AS1高表達(dá)與較差的總生存率和無瘤生存率相關(guān)。上述結(jié)果表明CBR3-AS1可能參與乳腺癌腫瘤進(jìn)展,并可作為潛在預(yù)后標(biāo)志物。

    本研究通過體外功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)揭示CBR3-AS1在乳腺癌腫瘤進(jìn)展中的作用。在體外,穩(wěn)定敲低CBR3-AS1可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖活力、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡;穩(wěn)定過表達(dá)CBR3-AS1可顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果提示CBR3-AS1作為致癌lncRNA在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。盡管如此,CBR3-AS1靶基因和乳腺癌致癌潛在機(jī)制尚不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA MALAT1作為miR-1靶標(biāo)參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡[25],lncRNA XIST敲低通過上調(diào)miR-152抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞腫瘤生長[26],上述結(jié)果提示lncRNA-miRNA功能網(wǎng)絡(luò)可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用,如文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-143調(diào)節(jié)ERBB3抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[27]。StarBase v 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測CBR3-AS1和miR-143之間可能存在結(jié)合位點(diǎn),因而進(jìn)一步研究CBR3-AS1-miR-143通路對乳腺癌的影響將有助于闡明CBR3-AS1在乳腺癌中發(fā)揮致癌作用的分子機(jī)制。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)CBR3-AS1在乳腺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào),與乳腺癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。CBR3-AS1作為致癌lncRNA參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡,可能是乳腺癌一種新的預(yù)后分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

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