高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲料中的5種添加劑

王林裴，周迎春，鄭亞哲，張亞瓊，李單單，華向美

（1.漯河海關(guān)，河南漯河 462000；2.啟迪桑德環(huán)境資源股份有限公司，北京 101012）

食品添加劑是指為改善食品品質(zhì)和色、香、味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的化學(xué)合成或者天然物質(zhì)[1]。近年來(lái)，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，食品添加劑使用頻率越來(lái)越多，違規(guī)使用或超量使用食品添加劑問(wèn)題也越頻繁，食品質(zhì)量安全問(wèn)題也越來(lái)越受到各方的關(guān)注。

目前，我國(guó)允許使用的食品添加劑種類(lèi)共23類(lèi)，包括乳化劑、增味劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑等[2]2 000多種。尤其是飲料的加工制作過(guò)程中可允許加入的食品添加劑種類(lèi)太多，這些添加劑大多沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且一旦這些添加劑使用量超標(biāo)，會(huì)對(duì)人體健康造成危害[3]。例如，當(dāng)攝入大量防腐劑時(shí)，輕則引起流口水、腹瀉、肚子疼痛及心跳加快等癥狀，重則對(duì)肝臟、胃和腎臟造成嚴(yán)重影響，甚至增大患癌癥風(fēng)險(xiǎn)[4]；苯甲酸鈉會(huì)在人體內(nèi)反應(yīng)生成苯甲酸而引起慢性苯中毒[5]；食用大量的甜味劑（如糖精鈉等），會(huì)影響腸胃消化酶的分泌，降低食欲。因此，檢測(cè)食品中添加劑的含量對(duì)保障食品安全及維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益均有重要意義。

安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸是5種常見(jiàn)的食品添加劑，國(guó)標(biāo)沒(méi)有規(guī)定同時(shí)檢測(cè)這幾種防腐劑、甜味劑的檢測(cè)方法，而是針對(duì)不同的添加劑類(lèi)別，其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)有3個(gè)[6-8]，其樣品處理方法不盡相同，過(guò)程繁瑣復(fù)雜，樣品量較大時(shí)，費(fèi)時(shí)耗力效率低，因此建立一種可同時(shí)檢測(cè)防腐劑、甜味劑的檢測(cè)方法顯得尤為關(guān)鍵[9]。

目前，已有的檢測(cè)食品添加劑的方法有光度法[10]、電位滴定法[11]、毛細(xì)管電泳法[12-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]、氣相色譜法[16]等，但是光度法、毛細(xì)管電泳法的靈敏度低、分辨率低、操作方法繁瑣；氣相色譜法雖然針對(duì)性較強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果精確度較高，但沒(méi)有廣泛的使用范圍[17]；液質(zhì)聯(lián)用對(duì)試驗(yàn)條件要求較高；液相色譜方法[18-20]最為普遍，有效提升了檢測(cè)靈敏度，有較好的分離度和準(zhǔn)確度，在食品安全分析檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。

試驗(yàn)針對(duì)不同飲料的特點(diǎn)，建立高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定飲料中常見(jiàn)食品添加劑的測(cè)定方法，將此方法應(yīng)用于大批量的飲料檢測(cè)中具有較高的檢測(cè)效率、精密度和準(zhǔn)確性，方法穩(wěn)定可靠[21]，也具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿啤、梨汁、水蜜桃汁，市售；乙酸銨（CH3CO2NH4，優(yōu)級(jí)純），國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司提供；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司提供；安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)溶液（DRE-C1001800）、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（DRE-C16901010），Dr.Ehrenstorfer公司提供；山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 （BW900997-1000-L，1 000 μg/mL）、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 （BW900998-1000-L，1 000 μg/mL），壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（21680），北京曼格生物科技公司提供。

注：實(shí)驗(yàn)室用水是由Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)制備的高純水，所用容器使用前均用超純水清洗晾干。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290系列（DAD檢測(cè)器） 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；Mill-Q Advantage A10型純水器，美國(guó)Millipore科技有限公司產(chǎn)品；MS303S型分析天平，瑞士梅特勒-托利多科技有限公司產(chǎn)品；UV2600型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，島津公司產(chǎn)品；超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 溶液配制

1.3.1 流動(dòng)相

溶劑A（0.02 mol/L乙酸銨溶液） 稱(chēng)取乙酸銨1.54 g，用水溶解，定容至1 000 mL容量瓶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30 min；溶劑B為色譜純甲醇。

1.3.2 亞鐵氰化鉀溶液

稱(chēng)取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL。

1.3.3 乙酸鋅溶液

稱(chēng)取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰醋酸，用水定容至1 000 mL。

1.3.4 安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 μg/mL）

準(zhǔn)確稱(chēng)量安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g用水溶解，定容至100 mL容量瓶。

1.3.5 糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 μg/mL）

準(zhǔn)確稱(chēng)量糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g用水溶解，定容至100 mL容量瓶。

1.3.6 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 μg/mL）

準(zhǔn)確稱(chēng)量脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g用水溶解，定容至100 mL容量瓶。

1.3.7 5種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（50 μg/mL）

分別吸取安賽蜜、糖精鈉、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，以及山梨酸、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL用水稀釋定容至50 mL。

1.3.8 5種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液

分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20，40，100，200，400，1 000 μL，加水定容至 1 mL，分別配制質(zhì)量濃度為 1，2，5，10，20，50 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理

稱(chēng)取約5.000 g樣品于50 mL比色管中，加水約25 mL渦旋混勻，含二氧化碳樣品置于超聲清洗儀中超聲處理20 min，不含蛋白質(zhì)樣品直接加水定容至刻度，含蛋白質(zhì)樣品分別加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，5 mL乙酸鋅溶液，然后加水至刻度，混勻，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，將上清液收集經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)待測(cè)。同樣方法作空白樣。（注：不含蛋白的飲料可以不加如亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液）

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Venusil ASB C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；進(jìn)樣量10 μL，柱溫35℃，DAD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流動(dòng)相A 0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B甲醇，A∶B=95∶5，等梯度洗脫。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液在1.4.2中色譜條件下進(jìn)行分析，以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）、相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

1.4.4 添加劑含量的計(jì)算

試樣中不同添加劑的含量計(jì)算公式：

式中：X——試樣中添加劑的含量，g/kg；

Co——空白樣品中添加劑的質(zhì)量濃度，μg/mL；

C——樣品中添加劑的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——試樣稀釋總體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

f——稀釋倍數(shù)；

1 000——換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)越性

由于飲料中會(huì)不同程度地添加果膠、黃瓜膠、羧甲基醋酸纖維鈉等添加劑來(lái)增加口感，因此對(duì)有些含乳飲料在前處理過(guò)程中需要沉淀蛋白，試驗(yàn)選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液作為蛋白沉淀劑。與國(guó)標(biāo)不同的是，標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23377—2009食品中脫氫乙酸的測(cè)定中，針對(duì)果蔬汁的測(cè)定中需要調(diào)節(jié)pH值，用固相萃取柱來(lái)提取，過(guò)程繁瑣復(fù)雜；GB/T 5009.140—2003飲料中乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜） 的測(cè)定中，樣品處理過(guò)程也需要用固相萃取柱上樣、洗脫，過(guò)程繁瑣。采用超聲提取方法簡(jiǎn)單、便于操作，大大減少了前處理的時(shí)間，同時(shí)保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于這幾種添加劑都易溶于水，且超聲提取過(guò)程中可以加快分子運(yùn)動(dòng)，加速沉淀劑與溶劑之間的接觸，促使某些成分脫附、溶解，加快提取過(guò)程，增大效率，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)分析得知，超聲提取20 min即可滿(mǎn)足加標(biāo)回收率要求。

2.2 流動(dòng)相的選擇

比較了在水/甲醇及乙酸銨溶液/甲醇2種流動(dòng)相體系下這5種添加劑的分離情況。

流動(dòng)相乙酸銨/甲醇=90∶10見(jiàn)圖1，流動(dòng)相水/甲醇=90∶10見(jiàn)圖2。

圖1 流動(dòng)相乙酸銨/甲醇=90∶10

圖2 流動(dòng)相水/甲醇=90∶10

由圖1和圖2可看出，乙酸銨/甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果較為理想。甲醇/水作為流動(dòng)相時(shí)，各組分出峰較為密集，峰型較差，不能得到有效分離。而乙酸銨/甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，分離效果理想，且峰型尖銳且對(duì)稱(chēng)，與甲醇/水體系相比靈敏度也有所提高，因此選擇乙酸銨/甲醇體系作為流動(dòng)相。調(diào)整流動(dòng)相比例來(lái)改善峰型及出峰時(shí)間，由分析可知，甲醇為10%時(shí)，這幾種添加劑分離效果及峰型相對(duì)較好，因此確定流動(dòng)相比例為乙酸銨∶甲醇=90∶10（V∶V）。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

多種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)時(shí)，不僅要保證每種組分的靈敏度，還需定量方法簡(jiǎn)便。試驗(yàn)采用分光光度計(jì)在190~400 nm范圍內(nèi)對(duì)各組標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，分析安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸這5種添加劑的吸光度圖譜可知，這5種組分的最大吸收波長(zhǎng)依次為228，220，226，254，235.5 nm。為兼顧各組分的檢測(cè)靈敏度，最終選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此條件下繪制檢測(cè)色譜圖，可以完全分離，且分離效果較好。

5種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 5種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.4 線(xiàn)性方程、檢出限及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

將安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸混標(biāo)工作液液稀釋成質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20，50 μg/mL混標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣 10 μL通過(guò)色譜條件來(lái)進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。取標(biāo)品逐級(jí)稀釋進(jìn)行檢測(cè)，確定5種添加劑的檢出限（以3倍信噪比計(jì)算，即S/N=3）和定量限（以10倍定量限計(jì)算，即S/N=10）。

5種食品添加劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，各組分在線(xiàn)性范圍內(nèi)均有良好的線(xiàn)性關(guān)系，方法檢出限為1.0~2.5 mg/kg，定量限為1.5~4.5 mg/kg。

2.5 方法精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)量7份空白樣品平行試樣，分別向其中加入等量混標(biāo)溶液，使得各組混標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為20 μg/mL，根據(jù)試驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理后測(cè)定，以峰面積對(duì)取得的測(cè)定值進(jìn)行表示。

方法精密度結(jié)果見(jiàn)表2。

經(jīng)計(jì)算，得到5種添加劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03%~0.29%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。

表1 5種食品添加劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表2 方法精密度結(jié)果（n =7）

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

以3種不同的飲料樣品為基質(zhì)，向其中加入5種添加劑混標(biāo)溶液，做10 μg/mL和80 μg/mL 2個(gè)質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)。

樣品中5種食品添加劑的加標(biāo)回收率見(jiàn)表3。

表3 樣品中5種食品添加劑的加標(biāo)回收率

由表3可知，5種添加劑在不同質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收率分別為89.3%~94.2%，85.2%~93.8%，85.7%~92.4%，81.9%~92.5%，84.3%~90.0%，均滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)GB/T 27404—2008中對(duì)回收率的要求。

2.7 方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證

采用飲料中安賽蜜定量分析質(zhì)控樣QC-FJ-705和果蔬汁中山梨酸、苯甲酸定量分析質(zhì)控樣QC-FJ-706來(lái)驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度.

實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果/mg·kg-1

由表4可知，該方法對(duì)飲料中山梨酸和苯甲酸、安賽蜜測(cè)定結(jié)果能與標(biāo)準(zhǔn)值保持一致。與2.6部分加標(biāo)回收率結(jié)果證明了該方法準(zhǔn)確度較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

質(zhì)控樣QC-FJ-706的色譜圖見(jiàn)圖4，質(zhì)控樣QC-FJ-705色譜圖見(jiàn)圖5。

圖4 質(zhì)控樣QC-FJ-706的色譜圖

圖5 質(zhì)控樣QC-FJ-705色譜圖

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

采用優(yōu)化后的儀器條件和操作方法對(duì)當(dāng)?shù)爻槿∈惺鄣?5種飲料各3批次，分別進(jìn)行5種添加劑含量的檢測(cè)。

不同飲料中5種添加劑含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同飲料中5種添加劑含量的測(cè)定結(jié)果/g·kg-1

根據(jù)表5中測(cè)定結(jié)果，不同類(lèi)別的飲料所含添加劑種類(lèi)、含量有所不同。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014[1]中食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，飲料類(lèi)中安賽蜜最大使用量為0.3 g/kg；對(duì)于山梨酸及其鉀鹽的含量，乳酸菌飲料最大使用量為1.0 g/kg，飲料類(lèi)最大使用量為0.5 g/kg；對(duì)于苯甲酸及其鈉鹽果蔬汁（漿）類(lèi)飲料不超過(guò)1.0 g/kg，蛋白飲料不超過(guò)1.0 g/kg，碳酸飲料不超過(guò)0.2 g/kg，茶、咖啡、植物（類(lèi)）飲不超過(guò)1.0 g/kg，特殊用途飲料不超過(guò)0.2 g/kg，風(fēng)味飲料不超過(guò)1.0 g/kg；冷凍飲品中糖精鈉含量不得超過(guò)0.15 g/kg；果蔬汁（漿）中脫氫乙酸含量不大于0.3 g/kg，被抽檢飲料中所含這5種添加劑均在國(guó)標(biāo)允許范圍內(nèi)添加，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有超標(biāo)使用情況。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜檢測(cè)法，可同時(shí)測(cè)定飲料中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸這5種常見(jiàn)的食品添加劑，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、分析時(shí)間短，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，且方法操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)，能夠滿(mǎn)足實(shí)際工作的需要，為食品監(jiān)管部門(mén)、企業(yè)等檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持。