云南建水豆腐酸漿中乳酸菌的分離與鑒定

劉琳琳 王嘉琪 曾劍華 楊春華 呂銘守 王 冰 張 娜 石彥國(guó)

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150076）

酸漿是豆腐制作過程中壓制后得到的黃漿水經(jīng)微生物發(fā)酵，pH 值逐漸降低，成為酸漿[1-2]。酸漿作為豆腐凝固劑已逾百年，酸漿豆腐在中國(guó)民間有上百年的歷史，其味道獨(dú)特，口感醇香細(xì)膩，彈性較好，屬天然綠色食品，深得消費(fèi)者的喜愛[3]。云南建水酸漿豆腐尤以歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特，久負(fù)盛名，遴選成為《舌尖上的中國(guó)》的經(jīng)典食材。然而，目前建水酸漿豆腐的制作大多數(shù)以家庭作坊或小工廠為主，且一直沿用傳統(tǒng)的手工生產(chǎn)方式[4]，其品質(zhì)僅憑借經(jīng)驗(yàn)豐富的“豆腐匠”來(lái)保持穩(wěn)定，且傳統(tǒng)酸漿豆腐生產(chǎn)模式的衛(wèi)生條件難以保證。如何工業(yè)化生產(chǎn)出品質(zhì)穩(wěn)定的酸漿豆腐，穩(wěn)定酸漿的品質(zhì)成了當(dāng)前的難題。

目前，云南建水酸漿的制作主要是以純正的老酸湯為引子，將豆腐壓制產(chǎn)生的黃漿水倒入其中，靜置1d，經(jīng)自然發(fā)酵而成，發(fā)酵形成的酸漿pH值在4 左右。此外，經(jīng)發(fā)酵，還賦予酸漿獨(dú)特的有機(jī)酸和菌群，研究表明，自然發(fā)酵酸漿中有機(jī)酸主要為L(zhǎng)-乳酸[5]，表明乳酸菌是酸漿中的主要微生物。如，孟克畢力克等[6]從內(nèi)蒙的自然發(fā)酵豆腐酸漿中分離得到4 株乳酸桿菌以及1 株明串珠球菌，并確定酸漿中主要產(chǎn)酸菌為乳桿菌屬的乳酸菌；胡欣欣[7]從湖南自然酸化的豆腐酸漿中分離鑒定出1 株嗜酸乳桿菌；尹向壟等[8]從許昌豆腐酸漿中分離得到1 株解淀粉乳桿菌，并應(yīng)用其制備酸漿凝固劑；喬支紅等[9]從多個(gè)地區(qū)的6 份酸漿老湯中分離純化出12 種乳酸菌，篩選出1 株產(chǎn)酸較快、較高的屎腸球菌乳酸菌；Li 等[10]從湖南自然發(fā)酵酸漿中分離出140 株乳酸菌，并確定了7 株乳酸菌發(fā)酵的酸漿能用于生產(chǎn)酸漿豆腐。由此可知酸漿中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌是制作酸漿豆腐的關(guān)鍵所在，直接關(guān)系到酸漿豆腐的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。乳酸菌是益生菌的主要來(lái)源之一，因其具有多種保健功效[11-14]，近年來(lái)研究者也在致力于找到更多好的乳酸菌資源應(yīng)用到食品中。經(jīng)適合的乳酸菌發(fā)酵而成的豆制品也越來(lái)越收到關(guān)注[15-16]。若實(shí)現(xiàn)了云南建水酸漿中的主要乳酸菌的分離選育，對(duì)酸漿進(jìn)行純種發(fā)酵，不僅為制備標(biāo)準(zhǔn)化酸漿和酸漿豆腐制作技術(shù)規(guī)范提供理論依據(jù)，對(duì)酸漿豆腐的規(guī)模化生產(chǎn)和推廣具有重要意義，還為開發(fā)新型益生菌發(fā)酵豆制品提供了新的資源來(lái)源。

本研究運(yùn)用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法和16SrRNA 基因序列分析法對(duì)云南建水豆腐酸漿中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿，云南建水酸漿豆腐生產(chǎn)用酸漿；MRS 肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）、DNA 凝膠回收試劑盒、Pfu DNA 聚合酶、DNA Marker，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BM2000 型光學(xué)顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；P302 型筆試pH 計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；JY5000 電泳儀，北京市君意機(jī)電技術(shù)公司；T100-PCR 擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；S-3400 掃描電鏡，天美日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集 酸漿采集自云南建水縣，將采集的樣品分裝于滅菌的容器內(nèi)，采用冰盒低溫保藏，在36 h 內(nèi)進(jìn)行菌種分離，并將樣品于冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 建水酸漿中乳酸菌的分離純化 取酸漿梯度稀釋后，分別取不同濃度的稀釋液0.2 mL，涂布于含有體積分?jǐn)?shù)2% CaCO3的MRS 培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的菌落劃線于固態(tài)MRS 培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。挑取單個(gè)菌落重復(fù)分離直至培養(yǎng)得到純種菌株。將菌株進(jìn)行編號(hào)，分別進(jìn)行4℃斜面短期保藏。

1.3.3 建水酸漿中乳酸菌的鑒定

1.3.3.1 建水酸漿中乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征鑒定[17]將菌落革蘭氏染色，然后在4×100 倍油鏡下觀察菌落的形態(tài)特征（顏色、大小、邊緣情況等）。初步鑒定以菌落形態(tài)中間隆起、靜止、無(wú)孢子且呈革蘭氏染色陽(yáng)性等特征的定為乳酸菌，然后分離純化得到純種菌株。

1.3.3.2 建水酸漿中乳酸菌的生理生化特征鑒定 對(duì)分離得到純菌株做運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、H2S 生成試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)及菌屬鑒定，均參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[18]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]。

1.3.3.3 建水酸漿中乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定[20-21]

①菌株DNA 的提取 按照天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行，并進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

②16SrDNA 基因序列的PCR 擴(kuò)增 在DNA完整的條件下，采用細(xì)菌通用引物（27F 為正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R為 反 向 引 物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系50 μL，含5.0 μL 10×PCR Buffer、1 μL 正向27F 引物、1 μL 反向1 492R 引物，1 μL 模版基因組DNA，0.5 μL 5 U/μL Pfu DNA 聚合酶，加水至50 μL。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：首先在95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變 性20 s，55 ℃退 火20 s，72 ℃延 伸50s，72 ℃修復(fù)延伸5 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。

③16SrDNA 的基因片段測(cè)序 PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后測(cè)序。

④登陸NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）網(wǎng)站，輸入16S rDNA 的測(cè)序結(jié)果，在Gen Bank 中進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，確定其屬種，采用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 每組試驗(yàn)平行3 次，采用Excel 2013 和SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

由于乳酸菌的產(chǎn)酸作用會(huì)使加有碳酸鈣的MRS 培養(yǎng)基上的菌落周圍產(chǎn)生溶鈣圈，所以在選擇性培養(yǎng)基上挑選出有溶鈣圈的菌落，將其在MRS 平板上經(jīng)過多次反復(fù)分離，結(jié)合革蘭氏染色，通過顯微鏡觀察，最終得到5 株革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)其編號(hào)并觀察、記錄各株菌的菌落形態(tài)，如圖1所示。在顯微鏡下觀察，菌體形態(tài)如圖2所示。在掃描電鏡下觀察，電鏡圖像如圖3所示。上述各菌株菌落及細(xì)胞主要形態(tài)特征如表1所示。通過形態(tài)學(xué)鑒定5 株菌均符合乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征，可初步判斷5 株菌株為乳酸菌。

2.2 生理生化鑒定

對(duì)分離的5 株菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表2。根據(jù)表2數(shù)據(jù)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》 初步判斷SYG01、SYG02、SYG03 和SYG05 屬 于 乳 桿 菌 屬（Lactobacillus），SYG04 屬于魏斯氏菌屬（Weissella）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

圖1 5 株菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of five strains

圖2 5 株菌株的革蘭氏染色圖Fig.2 Gram staining of five strains

圖3 5 株菌株在掃描電鏡（10k×）下的圖像Fig.3 SEM（10k×）photographs of cell morphology of five strains

2.3.1 菌株的DNA 提取及16S rDNA 序列擴(kuò)增5 株菌株分別接種于MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取菌體DNA，產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖4所示。分別以5 株菌的總DNA 為模板，27f 和1 492r 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，5 株菌在約1 500 bp 處均有特異性條帶，如圖4所示。

表1 5 株菌株的形態(tài)學(xué)特征Table 1 Morphological character of five stains

表2 5 株菌株的生理生化鑒定結(jié)果分析Table 2 Analysis of physiological and biochemical characterization for five stains

圖4 5 株菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of the five strains

圖5 5 株菌株的16S rDNA PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.5 Electrophoresis of the PCR amplification of 16S rDNA gene of the five strains

2.3.2 菌株的同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 分析結(jié)果表明，SYG01 的16S rRNA 序列共1 444 bp，SYG02 的16S rRNA 序列共1 456 bp，SYG03的16S rRNA 序 列 共1 445 bp，SYG04 的16S rRNA 序列共1 457 bp，SYG05 的16S rRNA 序列共1 456 bp。將序列結(jié)果用BLAST 進(jìn)行序列同源性比對(duì)，見表3。結(jié)果表明：5 株菌的同源性均達(dá)到99%，可以判定其屬于同一個(gè)種[22-23]。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rRNA 分子生物學(xué)鑒定，菌株SYG01、SYG02、SYG03、SYG04、SYG05 分別為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、Lactobacillus concavus。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖6。

表3 5 株菌株的同源性分析Table 3 Homology analysis of five strains

圖6 5 株菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of five strains

3 結(jié)論與討論

為實(shí)現(xiàn)云南建水酸漿中的主要乳酸菌分離選育，純種發(fā)酵酸漿，本研究從自然發(fā)酵的云南建水縣酸漿豆腐所用的酸漿中分離得到5 株乳酸菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16SrDNA 序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，SYG 01 為短乳桿菌，SYG 02 為棒狀乳桿菌，SYG 03 為彎曲乳桿菌，SYG 04 為融合魏斯氏菌，SYG 05 為L(zhǎng)actobacillus concavus。

傳統(tǒng)食品如豆制品、肉制品、泡菜、乳制品等食品的自然發(fā)酵生產(chǎn)有悠久的歷史，在發(fā)酵工業(yè)中有巨大的應(yīng)用潛力，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離優(yōu)勢(shì)菌已經(jīng)成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)[24]。云南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品由于其獨(dú)特的人文地理環(huán)境，創(chuàng)造出具有濃厚區(qū)域特色和風(fēng)味的豆制品，其中以酸漿豆腐最為出名。人們?cè)谥谱鬟@些傳統(tǒng)豆制品時(shí)往往會(huì)引入生物發(fā)酵技術(shù)，給這些豆制品帶來(lái)了特有的酵香風(fēng)味和特質(zhì)的口感。乳酸菌在這些自然發(fā)酵過程中起著重要作用。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的自然馴化，一些具有優(yōu)良特性的乳酸菌被很好地保留下來(lái)。研究表明，從食品自身中分離出的乳酸菌更有競(jìng)爭(zhēng)力，是該食品進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵的最優(yōu)菌株[25]。本研究在自然發(fā)酵酸漿中分離得到短乳桿菌、融合魏斯氏菌和Lactobacillus concavus，目前國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸漿中的乳酸菌呈多樣化性。分離得到的短乳桿菌、棒狀乳桿菌、彎曲乳桿菌廣泛存在于傳統(tǒng)的蔬菜、植物材料的發(fā)酵食品中，如酸菜[26-27]、豆醬[28-29]、泡菜[30-31]等，其中彎曲乳桿菌還存在于一些發(fā)酵肉制品中[32]，而融合魏斯氏菌在食品中也有應(yīng)用，如酸菜、水產(chǎn)品、乳產(chǎn)品[33-35]等。Lactobacillus concavus 從中國(guó)白酒窖墻壁中分離得到[36]。本研究通過分離鑒定酸漿中乳酸菌，為今后研究不同的乳酸菌對(duì)酸漿發(fā)酵風(fēng)味的影響，篩選合適的乳酸菌進(jìn)行純種發(fā)酵或混合菌發(fā)酵酸漿提供理論支撐，并對(duì)酸漿豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)有重要的意義。