高黏度殼聚糖回收魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的研究

靳 挺 沈科丞 施亞芳 武玉學(xué)

（浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 浙江寧波315100）

魚糜是指魚肉經(jīng)采肉、漂洗、脫水、攪拌混合等工序而制成的產(chǎn)品。魚糜的突出優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)豐富且無腥味，在市場上深受消費(fèi)者歡迎。對魚糜加工而言，漂洗工序極為重要，對魚糜的質(zhì)量及保藏性能均有重要作用。漂洗是指用清水或稀鹽水對魚肉進(jìn)行洗滌，除去水溶性蛋白質(zhì)、氣味和有色物質(zhì)，以提高魚糜的彈性和白度[1-3]。然而，漂洗工序產(chǎn)生了大量廢水，且富含水溶性蛋白質(zhì)等有機(jī)物，造成蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)[4]。如能回收魚糜漂洗液中的蛋白質(zhì)，則既可以提高水溶性蛋白的利用率，又能節(jié)約處理廢水的成本。

目前，從魚糜漂洗液中回收蛋白質(zhì)的方法有加熱法[5]、等電點(diǎn)沉淀法[6]、絮凝法[7]、膜分離法[8]等。加熱法具有耗能高，處理成本高等缺點(diǎn)，不宜廣泛使用。調(diào)節(jié)魚穈漂洗液的pH 至水溶性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH4.2～5.5，待蛋白質(zhì)沉淀后，漂洗液呈強(qiáng)酸性，不能直接排放，否則污染環(huán)境；在酸性條件下，肌原纖維膠凝過程發(fā)生改變，降低了魚糜的凝膠強(qiáng)度[9]。膜分離法的成本較高，且易堵塞膜孔，難以大規(guī)模使用。絮凝法具有方法簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，通過向魚糜漂洗液中加入絮凝劑，使水溶性蛋白質(zhì)凝聚沉降，達(dá)到回收目的。考慮到回收蛋白的再利用問題，從食品安全的角度出發(fā)，選擇殼聚糖作為絮凝材料，具有突出的優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖是以甲殼素為原料，經(jīng)脫鈣、除去蛋白質(zhì)和脂肪后，再經(jīng)脫乙酰基工序制備的高分子聚合物[10]。殼聚糖不溶于水，能溶于稀酸；在酸性環(huán)境下，分子中含有的游離氨基被質(zhì)子化，使殼聚糖分子鏈上帶正電，成為一種陽離子絮凝劑。與一般黏度的殼聚糖相比，高黏度殼聚糖（黏度＞400 mPa·s）的分子質(zhì)量大，聚合度高，黏度高，是一種性能更為優(yōu)良的絮凝劑。殼聚糖是一種食品添加劑（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2011），采用殼聚糖回收魚穈漂洗液中的水溶性蛋白質(zhì)，對于回收蛋白，重新用于食品加工過程，具有重要意義。

目前，國內(nèi)尚無高黏度殼聚糖 （黏度＞400 mPa·s）回收魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的報(bào)道。本文擬以低值小帶魚為原料制備魚糜，采用高黏度殼聚糖回收魚穈漂洗液中的水溶性蛋白質(zhì)，研究試驗(yàn)因素對蛋白質(zhì)回收的影響，得出優(yōu)化的回收工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

帶魚，儲(chǔ)存于-18 ℃冰箱中，使用前解凍，自來水清洗；高黏度殼聚糖（黏度＞400 mPa·s），上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；其它試劑均為分析純級，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752 型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平、DELTA 320pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-S 型水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；L-535R 臺(tái)式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備魚糜漂洗液 將冷凍帶魚進(jìn)行前處理（解凍、去頭及內(nèi)臟），采肉并稱重，按魚肉和漂洗水1∶3 的比例，用0.3%NaCl 溶液漂洗魚肉，保持漂洗水的溫度為4 ℃，攪拌10 min 后靜置10 min，用4 層紗布過濾，得到粗制漂洗液。將粗制漂洗液4 000 r/min 離心10 min，取上清液即精制魚糜漂洗液。

1.3.2 工藝條件對蛋白質(zhì)回收率的影響 采用單因素試驗(yàn)的方法，對pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間和殼聚糖濃度等因素進(jìn)行考察。在此基礎(chǔ)上，做正交試驗(yàn)L9（34）。表1為試驗(yàn)因素水平表。

表1 蛋白回收條件因素水平表Table The level design of protein recovery

1.3.3 蛋白質(zhì)回收率的測定 蛋白質(zhì)濃度的測定采用雙縮脲法[11]。

蛋白質(zhì)回收率計(jì)算公式：

式中，Y——蛋白質(zhì)回收率，%；X0——魚糜漂洗液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；X1——?dú)ぞ厶翘幚砗蟮钠匆旱鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 COD 去除率的測定 化學(xué)需氧量（COD）的測定采用重鉻酸鉀法[12]。

COD 去除率計(jì)算公式：

式中，R——COD 去除率，%；C0——魚糜漂洗液COD 值，mg/mL；C1——?dú)ぞ厶翘幚砗蟮钠匆篊OD 值，mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對蛋白質(zhì)回收率的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度1.67 mg/mL、pH7.5、作用時(shí)間60 min 的條件下，溫度分別設(shè)為15，20，25，30，35，40，45，50 ℃，考察溫度對高黏度殼聚糖回收蛋白質(zhì)效果的影響，結(jié)果如圖1所示。溫度是影響蛋白質(zhì)回收率的較重要的因素。殼聚糖與蛋白質(zhì)通過靜電吸附和橋連作用，使得蛋白質(zhì)膠體微粒結(jié)合而絮凝[13]。當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)，溫度上升，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，增加了殼聚糖與蛋白質(zhì)間的相互碰撞幾率，使蛋白質(zhì)的回收率增大；當(dāng)溫度超過20 ℃時(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇不利于殼聚糖對蛋白質(zhì)的吸附，使蛋白質(zhì)的回收率下降；隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)逐漸變性，回收率持續(xù)增大。蛋白質(zhì)回收的較優(yōu)溫度為20 ℃。

2.2 pH 值對蛋白質(zhì)回收率的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度1.67 mg/mL、溫度20 ℃、作用時(shí)間60 min 的條件下，將pH 分別設(shè)為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，考察pH 對高黏度殼聚糖回收蛋白質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。隨著pH 值的增大，蛋白質(zhì)回收率逐漸增加，當(dāng)pH 值6.5～7時(shí)，蛋白質(zhì)回收率呈下降趨勢。魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一般在pH 4.2～5.5，在弱酸性條件下，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，殼聚糖帶正電，當(dāng)二者靠近時(shí)，蛋白質(zhì)上的電荷被中和，蛋白質(zhì)脫穩(wěn)，碰撞沉淀即電中和作用[13]。另外，在弱酸性條件下，高黏度殼聚糖對蛋白質(zhì)的吸附速度相對較慢，有利于提高對蛋白質(zhì)的吸附效果。蛋白質(zhì)回收的較優(yōu)pH 值為6.5～7。

圖1 溫度對高黏度殼聚糖回收蛋白的影響Fig.1 The Effect of temperature on protein recovery by high viscosity chitosan

圖2 pH 對高黏度殼聚糖回收蛋白的影響Fig.2 The Effect of pH on protein recovery by high viscosity chitosan

2.3 作用時(shí)間對蛋白質(zhì)回收率的影響

在殼聚糖質(zhì)量濃度1.67 mg/mL、溫度20 ℃、pH 6.5 的條件下，作用時(shí)間分別設(shè)定為30，60，90，120，150，180，210 min，考察作用時(shí)間對高黏度殼聚糖回收蛋白質(zhì)效果的影響，結(jié)果見圖3。隨著作用時(shí)間的增加，殼聚糖與蛋白質(zhì)之間吸附架橋逐漸建立，蛋白質(zhì)回收率增加；當(dāng)作用時(shí)間大于90 min 時(shí)，高黏度殼聚糖與蛋白質(zhì)之間可能出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象，造成蛋白質(zhì)回收率呈下降趨勢[11]。蛋白質(zhì)回收的較優(yōu)作用時(shí)間為90 min。

2.4 殼聚糖濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響

在溫度20 ℃、pH 6.5，作用時(shí)間90 min 條件下，將殼聚糖質(zhì)量濃度分別設(shè)定為0.38，0.74，1.07，1.38，1.67，1.94，2.19 mg/mL，考察殼聚糖質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響，結(jié)果見圖4。隨著殼聚糖濃度的增大，蛋白質(zhì)回收率也隨之增加，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.38～2.19 mg/mL 時(shí)，蛋白質(zhì)回收率趨于穩(wěn)定，變化不大。殼聚糖濃度較低時(shí)，少量的殼聚糖吸附漂洗液中蛋白質(zhì)的量也較少，回收率較低；隨著殼聚糖濃度的增大，蛋白質(zhì)吸附量逐漸增加；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度達(dá)1.38 mg/mL 時(shí)，蛋白質(zhì)達(dá)到吸附平衡，此時(shí)再增加殼聚糖濃度，蛋白質(zhì)回收率變化不大。究其原因，一方面，殼聚糖和蛋白質(zhì)分子之間主要的作用力是離子鍵和氫鍵。殼聚糖通過離子鍵和氫鍵實(shí)現(xiàn)與多個(gè)蛋白質(zhì)分子的結(jié)合，起到橋梁連接作用，使蛋白質(zhì)分子形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而沉淀；另一方面，殼聚糖鏈狀分子的活性基團(tuán)與水溶性蛋白質(zhì)的相應(yīng)基團(tuán)發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，形成聚集沉淀[14]。

圖3 作用時(shí)間對高黏度殼聚糖回收蛋白的影響Fig.3 The Effect of time on protein recovery by high viscosity chitosan

圖4 殼聚糖濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響Fig.4 The Effect of concentration of high viscosity chitosan on protein recovery

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過正交試驗(yàn)得到不同試驗(yàn)條件下蛋白質(zhì)回收的結(jié)果，如表2所示。得出優(yōu)選試驗(yàn)方案為A1B2C2D2，即：pH6.5，溫度20 ℃，作用時(shí)間90 min，殼聚糖質(zhì)量濃度1.67 mg/mL。各因素對蛋白質(zhì)回收率的作用排序?yàn)椋簆H＞殼聚糖濃度＞作用時(shí)間＞溫度。在優(yōu)選試驗(yàn)條件下，高黏度殼聚糖對魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)回收率達(dá)43.68%。

2.6 COD 測定結(jié)果

在優(yōu)選試驗(yàn)條件下，測定高黏度殼聚糖處理前、后的魚糜漂洗液的COD，結(jié)果見表3。從表3可知，COD 去除率達(dá)到22.73%。分析原因，魚糜漂洗液中除了水溶性蛋白質(zhì)外，還含有脂肪、血色素和其它一些含氮物質(zhì)，這些物質(zhì)使漂洗液具有較高的COD，必須去除，才能大幅降低使魚糜漂洗液的COD。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal test

表3 魚糜漂洗液的COD 測定結(jié)果Table 3 The determination result of COD of surimi rinse

3 結(jié)論

采用高黏度殼聚糖回收魚糜漂洗液中的蛋白質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)研究了溫度、pH、作用時(shí)間、殼聚糖濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出優(yōu)化的試驗(yàn)條件。結(jié)論：在優(yōu)化的試驗(yàn)條件：pH 6.5，溫度20 ℃，作用時(shí)間90 min，殼聚糖質(zhì)量濃度1.67 mg/mL 下，高黏度殼聚糖對魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)回收率達(dá)43.68%，COD去除率為22.73%。

本文是首次利用高黏度殼聚糖 （黏度＞400 mPa·s）回收魚糜漂洗液中的蛋白質(zhì)，下步工作是對回收后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析及再利用，為提高魚糜生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益打下堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。