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    4-硝基苯甲酰氯柱前衍生-超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定煙葉中氨基酸

    2019-12-02 11:58:05黃曼艷陳森林林云陶紅阿文偉胡玉玲葉為民李攻科
    分析化學 2019年11期
    關(guān)鍵詞:酰氯硝基苯標準溶液

    黃曼艷 陳森林 林云 陶紅 阿文偉 胡玉玲 葉為民 李攻科

    摘 要 建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生、超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定煙葉中氨基酸的方法。樣品經(jīng)超聲輔助提取后,提取液與4-硝基苯甲酰氯可快速發(fā)生衍生化反應。優(yōu)化后的衍生化條件為: NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液(pH=9.0), 室溫下振蕩衍生1 min。此反應具有反應條件溫和、衍生時間短等優(yōu)點。通過優(yōu)化多通道反應監(jiān)測參數(shù),進一步提高了方法的靈敏度。方法的線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9951~0.9998之間,檢出限為0.01~2.10 μg/L,加標回收率為81.7%~103.6%,相對標準偏差為0.5%~8.0%,具有良好的穩(wěn)定性和精密度。采用本方法測定3種不同產(chǎn)地煙葉樣品中氨基酸含量,結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法進行分析,分類效果良好。

    關(guān)鍵詞 4-硝基苯甲酰氯; 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用; 衍生; 氨基酸; 煙葉

    1 引 言

    氨基酸是煙葉中的初級和次級代謝產(chǎn)物,在陳化過程中,與還原糖發(fā)生酶及非酶催化反應或自身降解生成致香成分,是煙葉中重要的香氣前體物質(zhì)。煙葉中氨基酸的組成和含量與煙葉的品質(zhì)有關(guān),每種氨基酸對香味的貢獻值不同??偘被岷颗c評吸總得分呈現(xiàn)二次曲線的相關(guān)關(guān)系,與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)。因此,常作為檢測煙葉品質(zhì)的重要指標,在煙葉中品質(zhì)研究中具有重要作用[1,2]。

    煙葉中氨基酸測定方法主要有氣相色譜法[3,4]、離子色譜法[5,6]、液相色譜法[7]和氨基酸流動分析法[8]等。由于氨基酸不易揮發(fā),當采用氣相色譜檢測時,常與N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide, BSTFA)等衍生化試劑反應生成易揮發(fā)物質(zhì)后進行測定。由于BSTFA遇水易失效,對反應條件要求較苛刻,穩(wěn)定性較差[9]。采用離子色譜測定時,基質(zhì)離子干擾較大,會影響定量分析的準確性。而氨基酸不具有紫外和熒光吸收,雖可采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定,但氨基酸極性大,不易保留,離子化效率較低[10,11]。因此,柱前衍生仍是目前氨基酸檢測的重要手段。食品和煙葉中氨基酸的檢測主要采用茚三酮作為柱前衍生試劑結(jié)合氨基酸流動分析儀進行測定,而柱前衍生結(jié)合液相色譜進行檢測較為簡便、靈敏和快速。常用的柱前衍生試劑主要有熒光胺(Fluorescamine, FA)、丹磺酰氯(Dansyl chloride, dansyl-Cl)[12,13],在衍生的過程中,會產(chǎn)生副產(chǎn)物,影響衍生產(chǎn)物的測定。氯甲酸-9-芴基甲酯(Fluorene methyl chloroformate, FMOC-Cl)[14]水解產(chǎn)物有熒光干擾,過量的衍生化試劑需用戊烷除去,操作繁瑣,定量結(jié)果偏差較大; 2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene, DNFB)[15]衍生過程中需要避光處理,容易產(chǎn)生副產(chǎn)物; 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)[16]是氨基酸衍生化試劑,加熱衍生5 min即可完成,但試劑較昂貴,且多余的衍生化試劑水解后也會產(chǎn)生較強的紫外吸收,其保留時間與丙氨酸接近,對丙氨酸的測定產(chǎn)生干擾。為提高衍生反應速率,減少實驗操作步驟,實現(xiàn)批量煙葉樣品的快速測定,發(fā)展氨基酸衍生化新方法具有重要意義。 4-硝基苯甲酰氯作為醇類、胺類物質(zhì)等[17~19]的衍生化試劑,其酰氯基團可與氨基酸中的氨基迅速發(fā)生?;磻?,而硝基又可降低衍生試劑的水解速度,因此具有反應條件溫和、衍生時間短、簡便快速等特點。

    本研究采用4-硝基苯甲酰氯作為衍生化試劑,與LC-MS/MS聯(lián)用測定煙葉中的氨基酸,并探究了不同產(chǎn)地煙葉中氨基酸含量的差異。結(jié)果表明,4-硝基苯甲酰氯可作為一種新型氨基酸衍生化試劑,應用于煙葉中氨基酸的測定。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    LC-MS 8050超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司); H1850高速離心機(湖南湘儀離心機有限責任公司); AB204-S電子天平、Mettler-Toledo FE20 臺式酸度計 (瑞士梅特勒-托利公司); KQ5200數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); 0.22 μm聚四氟乙烯過濾器(上海安譜科學儀器有限公司); 色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ(200 mm × 2.0 mm,2.2 μm, 日本島津公司)。

    20種氨基酸分析標準品(純度>98%,上海源葉生物科技公司), 均為L構(gòu)型; 乙腈(色譜純,DIMA公司); 甲酸(色譜純, Sigma公司); 4-硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯、3-硝基苯甲酰氯(色譜純,北京百靈威科技有限公司); 其它試劑均為分析純。實驗用水均為超純水(18.25 MΩ·cm,美國Millipore公司)。煙葉樣品由廣東中煙公司提供。

    2.2 標準溶液和樣品的制備

    分別稱取10.0 mg氨基酸標準品,用水溶解并定容至10.0 mL,稀釋配成10.0 mg/L混合母液,于4℃避光保存,待用。采用 0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液(pH 9.0)稀釋,配制二級標準儲備液,采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標準溶液。4-硝基苯甲酰氯采用無水乙腈配成10.0 mg/L的衍生試劑溶液。

    按照YC/T31-1996《煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法》[20]處理煙葉樣品。 準確稱取100.0 mg樣品,加水萃取10 min后,離心分離后所得的上清液用0.22 μm的水相濾膜過濾,得到萃取液。取100 μL萃取液,采用0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液(pH 9.0)稀釋至10.0 mL,待用。

    2.3 衍生化反應

    室溫下,取900 μL 10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液,加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑,振蕩1 min后進樣分析,完成萃取衍生,經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯 (PTFE) 濾膜過濾后進行測定。其反應方程式如下式。

    NO2+H2NCHRCOOHpH=9NO2ONHCHRCOOH

    2.4 色譜和質(zhì)譜條件

    色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ(200 mm×2.0 mm, 2.2 μm); 流動相A為0.1%甲酸,B為乙腈; 梯度洗脫: 0~15 min, 5%~70% B; 15~20 min, 70%~5% B,流速為0.3 mL/min,柱溫35℃,進樣量20 μL。

    電噴霧離子源(ESI); 毛細管電壓3.0 kV; 離子源溫度300℃; 脫溶劑氣溫度400℃; 脫溶劑氣流量650 L/h; 錐孔氣流量50 L/h; 負離子掃描模式,選擇多反應監(jiān)測(MRM)模式分析。

    2.5 數(shù)據(jù)處理

    應用SPSS-24軟件進行主成分分析和判別分析。煙葉香型由廣東中煙提供,其中1~11號產(chǎn)自貴州,12~23號產(chǎn)自湖南,24~37號產(chǎn)自云南。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 衍生反應機理

    4-硝基苯甲酰氯具有酰氯基團,可用于胺類物質(zhì)的衍生,具有較高的靈敏度[21]。由于酰氯基團較易水解,引入硝基可抑制其水解的速度,當氨基酸與酰氯基團完全反應后,多余的衍生化試劑發(fā)生水解,不影響衍生產(chǎn)物的測定。其部分產(chǎn)物離子掃描圖見圖1,分別代表4種氨基酸,在負離子模式下均出現(xiàn)母離子峰,說明此衍生反應符合取代反應的過程。由圖1A、1B、1C可知,當采用4-硝基苯甲酰氯為衍生化試劑時,均產(chǎn)生m/z 122.0和150.0的碎片離子,增大了離子的響應。此外,由圖2D可知,脯氨酸作為二級氨基酸,也產(chǎn)生m/z 122.0的碎片離子,說明此衍生化方法具有良好的適用性,可用于煙葉中一、二級氨基酸的測定。

    3.2 MRM方法的建立

    分別取900 μL 10.0 μg/L氨基酸單標準溶液,加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑反應后分別進行母離子和產(chǎn)物離子掃描,得出每個氨基酸衍生特征產(chǎn)物離子碎片。通過優(yōu)化定量離子對、最優(yōu)化碎裂電壓和電離能等,最終得到20種氨基酸多反應監(jiān)測(MRM)參數(shù)見表1。

    3.3 衍生條件的探究

    3.3.1 衍生試劑的選擇 為了探究硝基苯甲酰氯的衍生效果,在相同的衍生條件下分別考察3-硝基苯甲酰氯、4-硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯3種不同衍生化試劑的衍生效果,結(jié)果如圖2A所示。對比主要氨基酸衍生產(chǎn)物峰面積可知,4-硝基苯甲酰氯衍生產(chǎn)物峰面積更大,其衍生的效果更好,可能是因為當硝基處于對位時,能減少位阻的影響,更有利于發(fā)生親核取代反應。

    3.3.2 緩沖溶液pH值的選擇 考察了衍生化過程中緩沖溶液pH值對衍生化過程的影響。4-硝基苯甲酰氯在堿性條件下可與氨基酸發(fā)生反應,故在堿性條件下研究pH值的影響。取10.0 mg/L氨基酸混合溶液,分別采用pH為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0濃度為0.1 mol/L的NH4HCO3-HN3·H2O緩沖溶液稀釋成10.0 μg/L溶液。采用相同的方法衍生和測定,對比峰面積的差異。由圖2B可見,當pH=9.0時,除了脯氨酸的峰面積下降外,其它氨基酸的衍生效果最好,最終確定最佳pH=9.0。

    3.3.3 振蕩輔助衍生 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象,考察振蕩衍生時間分別為1、5、10、15和20 min時衍生反應結(jié)果。從圖3A可見,隨著時間增長,衍生產(chǎn)物峰面積差異不大,最終選擇振蕩衍生時間為1 min。從圖3B可見,采用振蕩輔助衍生的效果略優(yōu)于室溫下不經(jīng)輔助衍生的方式,脯氨酸在振蕩條件下的衍生效果較好。最終選擇室溫下振蕩輔助衍生作為后續(xù)的衍生方式。

    3.3.4 穩(wěn)定性 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象,在最佳的衍生條件下反應,探究批間和日間8 h內(nèi)衍生反應產(chǎn)物的穩(wěn)定性。通過峰面積的對比,批間相對標準偏差介于1.1%~6.0%,日間衍生產(chǎn)物峰面積變化不大,其相對標準偏差為2.3%~10.5%。結(jié)果表明,此衍生反應產(chǎn)物能夠穩(wěn)定存在,可以保證后續(xù)實驗中氨基酸的定量分析。

    3.4 分析方法性能和實際樣品的測定

    利用逐級稀釋法配制氨基酸混合標準溶液,與LC-MS/MS聯(lián)用進行測定,各氨基酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及回收率見表2,其中,天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的線性范圍為0.5~500 μg/L, 脯氨酸為0.1~1000 μg/L,其余氨基酸為0.5~100 μg/L,各氨基酸在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性,線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9951~0.9998之間,檢出限為0.01~2.10 μg/L,加標回收率為81.7%~103.6%, 滿足前處理和分析檢測方法的要求,可用于煙葉氨基酸的測定。不同氨基酸檢測方法對比結(jié)果如表3所示,此衍生化方法衍生時間短,操作簡便快速,檢出限低,可用于氨基酸含量的檢測。圖4A和4B分別為標準溶液色譜圖和煙葉樣品色譜圖。

    3.5 不同產(chǎn)地煙葉樣品的判別分類

    選擇3個產(chǎn)地的37份煙葉樣品,采用本方法測定煙葉中氨基酸的含量,并結(jié)合判別分析方法對樣品進行分類和判定。樣品的KMO值為0.811,樣品顯著性較強,前3個主成分累積貢獻率為83.85%,具有初步的分類效果。其樣品的方差分析見電子版文后支持信息表S1所示。在表4中,將貴州、湖南、云南樣品分別設定為1、2、3組,采用判別分析對樣品進行分析。在自身驗證中,樣品均未產(chǎn)生誤判,三者的總平均準確率為100%。在交互驗證中,其中有1份貴州樣品誤判為云南煙葉,湖南煙葉有2份誤判為云南煙葉,云南煙葉有1份誤判為貴州煙葉,判別準確率分別為90.9%、83.3%和85.7%, 而交互驗證的平均準確率為86.5%,說明本方法模型可應用于不同產(chǎn)地煙葉樣品的預測。

    4 結(jié) 論

    建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生與超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測定煙葉中氨基酸的方法。此衍生反應條件溫和,衍生時間僅為1 min,衍生完成后可直接進行測定。采用本方法測定3個不同產(chǎn)地煙葉樣品,結(jié)合多元統(tǒng)計分析對產(chǎn)地進行分析,判別分析的準確率為86.5%,具有良好的實用性。 本方法還可用于研究氨基酸與煙葉其它品質(zhì)的關(guān)系,為煙葉質(zhì)量判定提供依據(jù)。

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    Analysis of Amino Acids by Ultra High Performance Liquid

    Chromatography-Electrospray Ion Tandem Mass Spectrometry

    Using 4-Nitrobenzoyl Chloride as Precolumn Derivatization

    HUANG Man-Yan1, CHEN Sen-Lin2, LIN Yun2, TAO Hong2, A Wen-Wei1,

    HU Yu-Ling, YE Wei-Min2, LI Gong-Ke

    1(School of Chemistry, SunYat-sen University, Guangzhou 510275, China)

    2(China Tobacco Guangdong Industrial Co. Ltd., Guangzhou 510385, China)

    Abstract A pre-column derivatization method for determination of amino acids in tobacco leaves by ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ion tandem mass spectrometry using 4-nitrobenzoyl chloride as derivatization reagent was developed. The sample was extracted by ultrasound-assisted extraction, and then the extracts were rapidly derived with 4-nitrobenzoyl chloride. The derivative reaction was performed in NH4HCO3-NH3·H2O buffer solution at pH 9.0 and room temperature with oscillation assistance for 1 min. To enhance the sensitivity, the parameters of multiple reaction monitoring were also optimized. This method had many advantages including mild reaction condition, simple procedure and short derivatization time. The method showed a good linearity with correlation coefficients of 0.9951-0.9998. The detection limits were 0.56-2.00 μg/L with RSDs of 0.5%-8.0%. This method coupled with multivariate statistical analysis method was successfully employed for determination of amino acids in tobacco leaves from three different geographical origins, showing a good classification results.

    Keywords 4-Nitrobenzoyl chloride; Ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry; Derivatization; Amino acid; Classification

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