• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    4-硝基苯甲酰氯柱前衍生-超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定煙葉中氨基酸

    2019-12-02 11:58:05黃曼艷陳森林林云陶紅阿文偉胡玉玲葉為民李攻科
    分析化學 2019年11期
    關(guān)鍵詞:酰氯硝基苯標準溶液

    黃曼艷 陳森林 林云 陶紅 阿文偉 胡玉玲 葉為民 李攻科

    摘 要 建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生、超高效液相色譜/質(zhì)譜法測定煙葉中氨基酸的方法。樣品經(jīng)超聲輔助提取后,提取液與4-硝基苯甲酰氯可快速發(fā)生衍生化反應。優(yōu)化后的衍生化條件為: NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液(pH=9.0), 室溫下振蕩衍生1 min。此反應具有反應條件溫和、衍生時間短等優(yōu)點。通過優(yōu)化多通道反應監(jiān)測參數(shù),進一步提高了方法的靈敏度。方法的線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9951~0.9998之間,檢出限為0.01~2.10 μg/L,加標回收率為81.7%~103.6%,相對標準偏差為0.5%~8.0%,具有良好的穩(wěn)定性和精密度。采用本方法測定3種不同產(chǎn)地煙葉樣品中氨基酸含量,結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法進行分析,分類效果良好。

    關(guān)鍵詞 4-硝基苯甲酰氯; 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用; 衍生; 氨基酸; 煙葉

    1 引 言

    氨基酸是煙葉中的初級和次級代謝產(chǎn)物,在陳化過程中,與還原糖發(fā)生酶及非酶催化反應或自身降解生成致香成分,是煙葉中重要的香氣前體物質(zhì)。煙葉中氨基酸的組成和含量與煙葉的品質(zhì)有關(guān),每種氨基酸對香味的貢獻值不同??偘被岷颗c評吸總得分呈現(xiàn)二次曲線的相關(guān)關(guān)系,與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)。因此,常作為檢測煙葉品質(zhì)的重要指標,在煙葉中品質(zhì)研究中具有重要作用[1,2]。

    煙葉中氨基酸測定方法主要有氣相色譜法[3,4]、離子色譜法[5,6]、液相色譜法[7]和氨基酸流動分析法[8]等。由于氨基酸不易揮發(fā),當采用氣相色譜檢測時,常與N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide, BSTFA)等衍生化試劑反應生成易揮發(fā)物質(zhì)后進行測定。由于BSTFA遇水易失效,對反應條件要求較苛刻,穩(wěn)定性較差[9]。采用離子色譜測定時,基質(zhì)離子干擾較大,會影響定量分析的準確性。而氨基酸不具有紫外和熒光吸收,雖可采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定,但氨基酸極性大,不易保留,離子化效率較低[10,11]。因此,柱前衍生仍是目前氨基酸檢測的重要手段。食品和煙葉中氨基酸的檢測主要采用茚三酮作為柱前衍生試劑結(jié)合氨基酸流動分析儀進行測定,而柱前衍生結(jié)合液相色譜進行檢測較為簡便、靈敏和快速。常用的柱前衍生試劑主要有熒光胺(Fluorescamine, FA)、丹磺酰氯(Dansyl chloride, dansyl-Cl)[12,13],在衍生的過程中,會產(chǎn)生副產(chǎn)物,影響衍生產(chǎn)物的測定。氯甲酸-9-芴基甲酯(Fluorene methyl chloroformate, FMOC-Cl)[14]水解產(chǎn)物有熒光干擾,過量的衍生化試劑需用戊烷除去,操作繁瑣,定量結(jié)果偏差較大; 2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene, DNFB)[15]衍生過程中需要避光處理,容易產(chǎn)生副產(chǎn)物; 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)[16]是氨基酸衍生化試劑,加熱衍生5 min即可完成,但試劑較昂貴,且多余的衍生化試劑水解后也會產(chǎn)生較強的紫外吸收,其保留時間與丙氨酸接近,對丙氨酸的測定產(chǎn)生干擾。為提高衍生反應速率,減少實驗操作步驟,實現(xiàn)批量煙葉樣品的快速測定,發(fā)展氨基酸衍生化新方法具有重要意義。 4-硝基苯甲酰氯作為醇類、胺類物質(zhì)等[17~19]的衍生化試劑,其酰氯基團可與氨基酸中的氨基迅速發(fā)生?;磻?,而硝基又可降低衍生試劑的水解速度,因此具有反應條件溫和、衍生時間短、簡便快速等特點。

    本研究采用4-硝基苯甲酰氯作為衍生化試劑,與LC-MS/MS聯(lián)用測定煙葉中的氨基酸,并探究了不同產(chǎn)地煙葉中氨基酸含量的差異。結(jié)果表明,4-硝基苯甲酰氯可作為一種新型氨基酸衍生化試劑,應用于煙葉中氨基酸的測定。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    LC-MS 8050超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(日本島津公司); H1850高速離心機(湖南湘儀離心機有限責任公司); AB204-S電子天平、Mettler-Toledo FE20 臺式酸度計 (瑞士梅特勒-托利公司); KQ5200數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); 0.22 μm聚四氟乙烯過濾器(上海安譜科學儀器有限公司); 色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ(200 mm × 2.0 mm,2.2 μm, 日本島津公司)。

    20種氨基酸分析標準品(純度>98%,上海源葉生物科技公司), 均為L構(gòu)型; 乙腈(色譜純,DIMA公司); 甲酸(色譜純, Sigma公司); 4-硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯、3-硝基苯甲酰氯(色譜純,北京百靈威科技有限公司); 其它試劑均為分析純。實驗用水均為超純水(18.25 MΩ·cm,美國Millipore公司)。煙葉樣品由廣東中煙公司提供。

    2.2 標準溶液和樣品的制備

    分別稱取10.0 mg氨基酸標準品,用水溶解并定容至10.0 mL,稀釋配成10.0 mg/L混合母液,于4℃避光保存,待用。采用 0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液(pH 9.0)稀釋,配制二級標準儲備液,采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標準溶液。4-硝基苯甲酰氯采用無水乙腈配成10.0 mg/L的衍生試劑溶液。

    按照YC/T31-1996《煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法》[20]處理煙葉樣品。 準確稱取100.0 mg樣品,加水萃取10 min后,離心分離后所得的上清液用0.22 μm的水相濾膜過濾,得到萃取液。取100 μL萃取液,采用0.1 mol/L NH4HCO3-NH3·H2O緩沖溶液(pH 9.0)稀釋至10.0 mL,待用。

    2.3 衍生化反應

    室溫下,取900 μL 10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液,加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑,振蕩1 min后進樣分析,完成萃取衍生,經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯 (PTFE) 濾膜過濾后進行測定。其反應方程式如下式。

    NO2+H2NCHRCOOHpH=9NO2ONHCHRCOOH

    2.4 色譜和質(zhì)譜條件

    色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ(200 mm×2.0 mm, 2.2 μm); 流動相A為0.1%甲酸,B為乙腈; 梯度洗脫: 0~15 min, 5%~70% B; 15~20 min, 70%~5% B,流速為0.3 mL/min,柱溫35℃,進樣量20 μL。

    電噴霧離子源(ESI); 毛細管電壓3.0 kV; 離子源溫度300℃; 脫溶劑氣溫度400℃; 脫溶劑氣流量650 L/h; 錐孔氣流量50 L/h; 負離子掃描模式,選擇多反應監(jiān)測(MRM)模式分析。

    2.5 數(shù)據(jù)處理

    應用SPSS-24軟件進行主成分分析和判別分析。煙葉香型由廣東中煙提供,其中1~11號產(chǎn)自貴州,12~23號產(chǎn)自湖南,24~37號產(chǎn)自云南。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 衍生反應機理

    4-硝基苯甲酰氯具有酰氯基團,可用于胺類物質(zhì)的衍生,具有較高的靈敏度[21]。由于酰氯基團較易水解,引入硝基可抑制其水解的速度,當氨基酸與酰氯基團完全反應后,多余的衍生化試劑發(fā)生水解,不影響衍生產(chǎn)物的測定。其部分產(chǎn)物離子掃描圖見圖1,分別代表4種氨基酸,在負離子模式下均出現(xiàn)母離子峰,說明此衍生反應符合取代反應的過程。由圖1A、1B、1C可知,當采用4-硝基苯甲酰氯為衍生化試劑時,均產(chǎn)生m/z 122.0和150.0的碎片離子,增大了離子的響應。此外,由圖2D可知,脯氨酸作為二級氨基酸,也產(chǎn)生m/z 122.0的碎片離子,說明此衍生化方法具有良好的適用性,可用于煙葉中一、二級氨基酸的測定。

    3.2 MRM方法的建立

    分別取900 μL 10.0 μg/L氨基酸單標準溶液,加入100 μL 10.0 mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化試劑反應后分別進行母離子和產(chǎn)物離子掃描,得出每個氨基酸衍生特征產(chǎn)物離子碎片。通過優(yōu)化定量離子對、最優(yōu)化碎裂電壓和電離能等,最終得到20種氨基酸多反應監(jiān)測(MRM)參數(shù)見表1。

    3.3 衍生條件的探究

    3.3.1 衍生試劑的選擇 為了探究硝基苯甲酰氯的衍生效果,在相同的衍生條件下分別考察3-硝基苯甲酰氯、4-硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯3種不同衍生化試劑的衍生效果,結(jié)果如圖2A所示。對比主要氨基酸衍生產(chǎn)物峰面積可知,4-硝基苯甲酰氯衍生產(chǎn)物峰面積更大,其衍生的效果更好,可能是因為當硝基處于對位時,能減少位阻的影響,更有利于發(fā)生親核取代反應。

    3.3.2 緩沖溶液pH值的選擇 考察了衍生化過程中緩沖溶液pH值對衍生化過程的影響。4-硝基苯甲酰氯在堿性條件下可與氨基酸發(fā)生反應,故在堿性條件下研究pH值的影響。取10.0 mg/L氨基酸混合溶液,分別采用pH為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0濃度為0.1 mol/L的NH4HCO3-HN3·H2O緩沖溶液稀釋成10.0 μg/L溶液。采用相同的方法衍生和測定,對比峰面積的差異。由圖2B可見,當pH=9.0時,除了脯氨酸的峰面積下降外,其它氨基酸的衍生效果最好,最終確定最佳pH=9.0。

    3.3.3 振蕩輔助衍生 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象,考察振蕩衍生時間分別為1、5、10、15和20 min時衍生反應結(jié)果。從圖3A可見,隨著時間增長,衍生產(chǎn)物峰面積差異不大,最終選擇振蕩衍生時間為1 min。從圖3B可見,采用振蕩輔助衍生的效果略優(yōu)于室溫下不經(jīng)輔助衍生的方式,脯氨酸在振蕩條件下的衍生效果較好。最終選擇室溫下振蕩輔助衍生作為后續(xù)的衍生方式。

    3.3.4 穩(wěn)定性 以10.0 μg/L氨基酸混合標準溶液為分析對象,在最佳的衍生條件下反應,探究批間和日間8 h內(nèi)衍生反應產(chǎn)物的穩(wěn)定性。通過峰面積的對比,批間相對標準偏差介于1.1%~6.0%,日間衍生產(chǎn)物峰面積變化不大,其相對標準偏差為2.3%~10.5%。結(jié)果表明,此衍生反應產(chǎn)物能夠穩(wěn)定存在,可以保證后續(xù)實驗中氨基酸的定量分析。

    3.4 分析方法性能和實際樣品的測定

    利用逐級稀釋法配制氨基酸混合標準溶液,與LC-MS/MS聯(lián)用進行測定,各氨基酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及回收率見表2,其中,天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的線性范圍為0.5~500 μg/L, 脯氨酸為0.1~1000 μg/L,其余氨基酸為0.5~100 μg/L,各氨基酸在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性,線性相關(guān)系數(shù)R2在0.9951~0.9998之間,檢出限為0.01~2.10 μg/L,加標回收率為81.7%~103.6%, 滿足前處理和分析檢測方法的要求,可用于煙葉氨基酸的測定。不同氨基酸檢測方法對比結(jié)果如表3所示,此衍生化方法衍生時間短,操作簡便快速,檢出限低,可用于氨基酸含量的檢測。圖4A和4B分別為標準溶液色譜圖和煙葉樣品色譜圖。

    3.5 不同產(chǎn)地煙葉樣品的判別分類

    選擇3個產(chǎn)地的37份煙葉樣品,采用本方法測定煙葉中氨基酸的含量,并結(jié)合判別分析方法對樣品進行分類和判定。樣品的KMO值為0.811,樣品顯著性較強,前3個主成分累積貢獻率為83.85%,具有初步的分類效果。其樣品的方差分析見電子版文后支持信息表S1所示。在表4中,將貴州、湖南、云南樣品分別設定為1、2、3組,采用判別分析對樣品進行分析。在自身驗證中,樣品均未產(chǎn)生誤判,三者的總平均準確率為100%。在交互驗證中,其中有1份貴州樣品誤判為云南煙葉,湖南煙葉有2份誤判為云南煙葉,云南煙葉有1份誤判為貴州煙葉,判別準確率分別為90.9%、83.3%和85.7%, 而交互驗證的平均準確率為86.5%,說明本方法模型可應用于不同產(chǎn)地煙葉樣品的預測。

    4 結(jié) 論

    建立了4-硝基苯甲酰氯柱前衍生與超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用測定煙葉中氨基酸的方法。此衍生反應條件溫和,衍生時間僅為1 min,衍生完成后可直接進行測定。采用本方法測定3個不同產(chǎn)地煙葉樣品,結(jié)合多元統(tǒng)計分析對產(chǎn)地進行分析,判別分析的準確率為86.5%,具有良好的實用性。 本方法還可用于研究氨基酸與煙葉其它品質(zhì)的關(guān)系,為煙葉質(zhì)量判定提供依據(jù)。

    References

    1 Tomita H, Noguchi M, Tamaki E. Agric. Biol. Chem., 1965, 29: 959-961

    2WANG Shu-Sheng, WANG Bao-Hua, LI Xue-Zhen, LI Xin-Feng. Chinese Tobacco Science,? 2002,? 23(4): 4-7

    王樹聲, 王寶華, 李雪震, 李新峰. 中國煙草科學,? 2002,? 23(4):4-7

    3 Ali H, Ptzold R, Brückner H. Food Chem.,? 2006,? 99(4): 803-812

    4 Li G, Wu D, Xie W Y, Sha Y F, Lin H Q, Liu B Z. J. Chromatogr. A,? 2013,? 1296: 243-247

    5 Csomos E, Simon-Sarkadi L. Chromatographia,? 2002,? 56(1): S185-S188

    6 Takano Y, Chikaraishi Y, Ohkouchi N. Int. J. Mass Spectrom.,? 2015,? 379: 16-25

    7 Nimbalkar M S, Pai S R, Pawar N V, Oulkar D, Dixit G B. Food Chem.,? 2012,? 134(4): 2565-2569

    8 Zeng Y H, Cai W S, Shao X G. J. Sep. Sci.,? 2015,? 38(12): 2053-2058

    9 Deng C H, Yin X Y, Zhang L J, Zhang X G. Rapid Commun. Mass Spectrom.,? 2005,? 19(16): 2227-2234

    10 Deng P, Zhan Y, Chen X Y, Zhong D F. Bioanalysis, 2012, 4(1): 49-69

    11 Ohno K I, Yamashita K. Bioanalysis,? 2015,? 7(19): 2489-2499

    12 Mottier N, Jeanneret F. J. Agric. Food Chem.,? 2011,? 59(1): 92-97

    13 Zheng G H, Jin W W, Fan P, Bai Y, Tao T, Yu L J. Int. J. Mass Spectrom.,? 2015,? 392: 1-6

    14 Rebane R, Oldekop M L, Herodes K. J. Chromatogr. B,? 2014,? 955: 34-41

    15Li N N, Liu Y, Zhao Y, Zheng X Q, Lu J L, Liang Y R. Food Anal. Method,? 2016,? 9(5): 1307-1314

    16 Nakamura H, Karakawa S, Watanabe A, Kuwahara T, Shimbo K, Sakai R. Anal. Biochem.,? 2015,? 476: 67-77

    17 Blazsek M, Kubi M. J. Pharm. Biomed. Anal.,? 2005,? 39(3-4): 564-571

    18 Nojiri S, Taguchi N, Oishi M, Suzuki S. J. Chromatogr. A,? 2000,? 893(1): 195-200

    19 Kirschbaum J, Rebscher K, Brückner H. J. Chromatogr. A,? 2000,? 881(1-2): 517-530

    20 YC/T31-1996, Tobacco and Tobacco Products-Preparation of Test Sample and Determination of Water Content-Oven Method, Standards for Tobacco Industry of the People's Republic of China

    煙草及煙草制品試樣的制備和水分測定烘箱法. 中華人民共和國煙草行業(yè)標準. YC/T31-1996

    21 Hori Y, Fujisawa M, Shimada K, Sato M, Kikuchi M, Honda M, Hirose Y. J. Chromatogr. B,? 2002,? 767(2): 255-262

    22 Zhang J J, Zhan C X, Chang Y W, Zhao Y N, Li Q H, Xu G W. J. Sep. Sci.,? 2013,? 36(17): 2868-2877

    23 Ziegler J, Abel S. Amino Acids,? 2014,? 46(12): 2799-2808

    24 Jing Y Q, Zhang B L, Yuan X X, Gao Y Z, Lu P, Wang W F, Xu M. Saudi J. Biol. Sci.,? 2016,? 23(1): S64-S68

    Analysis of Amino Acids by Ultra High Performance Liquid

    Chromatography-Electrospray Ion Tandem Mass Spectrometry

    Using 4-Nitrobenzoyl Chloride as Precolumn Derivatization

    HUANG Man-Yan1, CHEN Sen-Lin2, LIN Yun2, TAO Hong2, A Wen-Wei1,

    HU Yu-Ling, YE Wei-Min2, LI Gong-Ke

    1(School of Chemistry, SunYat-sen University, Guangzhou 510275, China)

    2(China Tobacco Guangdong Industrial Co. Ltd., Guangzhou 510385, China)

    Abstract A pre-column derivatization method for determination of amino acids in tobacco leaves by ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ion tandem mass spectrometry using 4-nitrobenzoyl chloride as derivatization reagent was developed. The sample was extracted by ultrasound-assisted extraction, and then the extracts were rapidly derived with 4-nitrobenzoyl chloride. The derivative reaction was performed in NH4HCO3-NH3·H2O buffer solution at pH 9.0 and room temperature with oscillation assistance for 1 min. To enhance the sensitivity, the parameters of multiple reaction monitoring were also optimized. This method had many advantages including mild reaction condition, simple procedure and short derivatization time. The method showed a good linearity with correlation coefficients of 0.9951-0.9998. The detection limits were 0.56-2.00 μg/L with RSDs of 0.5%-8.0%. This method coupled with multivariate statistical analysis method was successfully employed for determination of amino acids in tobacco leaves from three different geographical origins, showing a good classification results.

    Keywords 4-Nitrobenzoyl chloride; Ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry; Derivatization; Amino acid; Classification

    猜你喜歡
    酰氯硝基苯標準溶液
    TB-COP 對I2和硝基苯酚的吸附性能及機理研究
    碘標準溶液的均勻性、穩(wěn)定性及不確定度研究
    電感耦合等離子發(fā)射光譜法快速測定對苯二甲酰氯中氯化亞砜殘留量
    分析化學(2019年3期)2019-03-30 10:59:24
    Portal vein embolization for induction of selective hepatic hypertrophy prior to major hepatectomy: rationale, techniques, outcomes and future directions
    標準溶液配制及使用中容易忽略的問題
    中國氯堿(2016年9期)2016-11-16 03:07:39
    高品質(zhì)間苯二甲酰氯的合成工藝
    生物化工(2016年4期)2016-04-08 10:26:27
    酰氯化合物在合成過程中液相監(jiān)控
    硝基苯催化加氫Pt-MoS2/C催化劑的制備及使用壽命的研究
    應用化工(2014年4期)2014-08-16 13:23:09
    混二氯硝基苯氯化制備1,2,4-/1,2,3-三氯苯
    中國氯堿(2014年10期)2014-02-28 01:04:59
    銅標準溶液的配制及定值
    日本在线视频免费播放| 精品人妻1区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品日韩av在线免费观看| videossex国产| 免费看av在线观看网站| 欧美+日韩+精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 听说在线观看完整版免费高清| 在现免费观看毛片| 久久人妻av系列| 99久久九九国产精品国产免费| av中文乱码字幕在线| 九色成人免费人妻av| 狠狠狠狠99中文字幕| 色视频www国产| 亚洲不卡免费看| 1024手机看黄色片| 亚洲精品成人久久久久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚州av有码| 国内精品一区二区在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美一级a爱片免费观看看| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产亚洲精品久久久com| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美黑人巨大hd| 国产成人影院久久av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产亚洲精品久久久com| 国产成人aa在线观看| 无人区码免费观看不卡| 性欧美人与动物交配| 又爽又黄无遮挡网站| 中文字幕免费在线视频6| 日韩欧美国产在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 97热精品久久久久久| 免费黄网站久久成人精品| 色5月婷婷丁香| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 1024手机看黄色片| 少妇的逼水好多| 国产免费一级a男人的天堂| 99热网站在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲欧美日韩东京热| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 好男人在线观看高清免费视频| 天堂网av新在线| 国产一区二区三区视频了| 97超视频在线观看视频| 在现免费观看毛片| 中文字幕高清在线视频| 22中文网久久字幕| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一本一本综合久久| 日韩欧美在线二视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av中文av极速乱 | 美女高潮的动态| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美激情在线99| 免费黄网站久久成人精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 男人的好看免费观看在线视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 一区二区三区高清视频在线| 九色成人免费人妻av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲专区中文字幕在线| 免费大片18禁| 国产精品永久免费网站| 国内精品美女久久久久久| 88av欧美| 精品人妻熟女av久视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩欧美三级三区| 乱系列少妇在线播放| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲无线在线观看| 韩国av在线不卡| 欧美日本视频| 一级a爱片免费观看的视频| 国产高清有码在线观看视频| 又爽又黄a免费视频| 国产视频一区二区在线看| 国产精品一及| 欧美色视频一区免费| 免费人成在线观看视频色| 中文字幕av成人在线电影| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲成a人片在线一区二区| 一个人看视频在线观看www免费| 91av网一区二区| 夜夜爽天天搞| 精品人妻一区二区三区麻豆 | av天堂在线播放| 亚洲av一区综合| 久久草成人影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一区福利在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 大型黄色视频在线免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| aaaaa片日本免费| 亚洲性久久影院| 黄片wwwwww| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人综合一区亚洲| 国产精品综合久久久久久久免费| 舔av片在线| 又爽又黄无遮挡网站| 看十八女毛片水多多多| 少妇的逼好多水| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美人与善性xxx| 婷婷色综合大香蕉| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 久久人人精品亚洲av| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品久久久久久久久久久久久| 国内精品美女久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 永久网站在线| 日韩欧美免费精品| 亚洲人成网站在线播| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费看a级黄色片| 色播亚洲综合网| 热99re8久久精品国产| 免费看av在线观看网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精品,欧美在线| 国产高清视频在线观看网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人aa在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲午夜理论影院| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 此物有八面人人有两片| 一a级毛片在线观看| 国产精品三级大全| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美潮喷喷水| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 国产伦在线观看视频一区| 国产主播在线观看一区二区| 很黄的视频免费| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产成人福利小说| 亚洲男人的天堂狠狠| 国内精品美女久久久久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日本在线视频免费播放| 国产精品福利在线免费观看| 性色avwww在线观看| 国产在线男女| 亚洲av.av天堂| 乱系列少妇在线播放| 亚洲最大成人中文| 有码 亚洲区| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久精品影院6| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲最大成人中文| 国国产精品蜜臀av免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 亚洲va在线va天堂va国产| 国产在线男女| av国产免费在线观看| 久久午夜福利片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 丰满的人妻完整版| 成年免费大片在线观看| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久大精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩欧美免费精品| 可以在线观看毛片的网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 色综合站精品国产| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜福利高清视频| 久久午夜福利片| 国产精品人妻久久久久久| 久久99热这里只有精品18| 乱系列少妇在线播放| 免费无遮挡裸体视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久人妻av系列| 深夜a级毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| 不卡视频在线观看欧美| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲av成人精品一区久久| 国产三级在线视频| 精品一区二区三区视频在线| 在线观看免费视频日本深夜| 一夜夜www| 久久久精品大字幕| 免费av毛片视频| 国产中年淑女户外野战色| 国产乱人伦免费视频| 九九热线精品视视频播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产精品精品国产色婷婷| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 午夜免费成人在线视频| 国产精品精品国产色婷婷| 男人的好看免费观看在线视频| 色av中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 久久中文看片网| 天美传媒精品一区二区| 国产成人av教育| 性欧美人与动物交配| 国产在线男女| 午夜福利高清视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久久国内视频| 久久人妻av系列| 一区二区三区高清视频在线| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 制服丝袜大香蕉在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品99久久久久久久久| 成年女人永久免费观看视频| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 岛国在线免费视频观看| 国产精品人妻久久久久久| 88av欧美| 日韩欧美在线二视频| 免费看a级黄色片| 最近在线观看免费完整版| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美高清成人免费视频www| 少妇熟女aⅴ在线视频| 如何舔出高潮| 天天一区二区日本电影三级| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本一二三区视频观看| av在线老鸭窝| 久久精品人妻少妇| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品不卡国产一区二区三区| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜精品一区二区三区免费看| 一个人看的www免费观看视频| 国产免费av片在线观看野外av| 午夜精品在线福利| 免费av观看视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 日本一二三区视频观看| 午夜视频国产福利| 精品人妻视频免费看| 最近最新免费中文字幕在线| 内地一区二区视频在线| 成年版毛片免费区| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 国产爱豆传媒在线观看| av在线天堂中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| av天堂中文字幕网| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲欧美日韩高清专用| 淫妇啪啪啪对白视频| 成人av一区二区三区在线看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美丝袜亚洲另类 | 草草在线视频免费看| 高清毛片免费观看视频网站| 在线观看66精品国产| 制服丝袜大香蕉在线| 看黄色毛片网站| 五月玫瑰六月丁香| 国产色爽女视频免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99热这里只有是精品50| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久久性生活片| 亚洲真实伦在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 小说图片视频综合网站| 性色avwww在线观看| h日本视频在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产午夜精品论理片| 久久久久久大精品| 18+在线观看网站| 五月玫瑰六月丁香| 中文字幕久久专区| 亚洲18禁久久av| 国产 一区 欧美 日韩| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品国产三级普通话版| 日本在线视频免费播放| 草草在线视频免费看| 免费看av在线观看网站| av在线观看视频网站免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 18+在线观看网站| 精品久久国产蜜桃| 日本三级黄在线观看| 男人舔奶头视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美+日韩+精品| 天堂动漫精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 18+在线观看网站| 精品国产三级普通话版| 人妻少妇偷人精品九色| 国产毛片a区久久久久| 哪里可以看免费的av片| 99久国产av精品| 欧美三级亚洲精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 嫩草影视91久久| 欧美性感艳星| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 人人妻人人澡欧美一区二区| 在线观看午夜福利视频| 天堂影院成人在线观看| 97碰自拍视频| 亚洲五月天丁香| 国产av一区在线观看免费| 全区人妻精品视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人国产综合亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 韩国av在线不卡| 麻豆成人av在线观看| 变态另类丝袜制服| 国产精品伦人一区二区| 日本成人三级电影网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 色尼玛亚洲综合影院| 国产爱豆传媒在线观看| av视频在线观看入口| 欧美潮喷喷水| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲第一电影网av| 亚州av有码| 久久久精品大字幕| 久久久久久国产a免费观看| 午夜视频国产福利| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美+日韩+精品| 69人妻影院| 国产精品乱码一区二三区的特点| av视频在线观看入口| 人人妻人人看人人澡| 欧美激情国产日韩精品一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 国产精华一区二区三区| 尾随美女入室| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩欧美精品免费久久| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 亚洲av美国av| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品一区二区性色av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人一区二区视频在线观看| 草草在线视频免费看| 日本黄色片子视频| 色哟哟哟哟哟哟| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 看黄色毛片网站| 亚洲自偷自拍三级| 午夜福利成人在线免费观看| 久久热精品热| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 天美传媒精品一区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一本久久中文字幕| 国产乱人视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲图色成人| 亚州av有码| 国产伦精品一区二区三区四那| 嫩草影院精品99| 国产探花极品一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产免费一级a男人的天堂| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品日韩av片在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产高清有码在线观看视频| 熟女电影av网| 亚洲精品亚洲一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 看片在线看免费视频| 看黄色毛片网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜激情福利司机影院| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久亚洲真实| 国产午夜精品论理片| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 婷婷色综合大香蕉| aaaaa片日本免费| 午夜福利高清视频| 国内精品宾馆在线| 国产视频一区二区在线看| 成人午夜高清在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 九九热线精品视视频播放| 窝窝影院91人妻| 久久久久久久久久黄片| 黄色丝袜av网址大全| 日韩精品有码人妻一区| 91麻豆av在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲专区中文字幕在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 在线天堂最新版资源| 久久午夜福利片| 亚洲色图av天堂| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 不卡视频在线观看欧美| 69av精品久久久久久| 韩国av一区二区三区四区| 狠狠狠狠99中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 草草在线视频免费看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲avbb在线观看| 午夜福利欧美成人| 午夜福利成人在线免费观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 人妻少妇偷人精品九色| 精品一区二区三区人妻视频| 成人性生交大片免费视频hd| 午夜福利在线在线| 成人av在线播放网站| 日韩一本色道免费dvd| 国产成人aa在线观看| 日日啪夜夜撸| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 国产精品久久电影中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产在视频线在精品| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美3d第一页| 久久热精品热| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品电影一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本精品一区二区三区蜜桃| 天堂影院成人在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久久伊人网av| 级片在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 久久久久久久久中文| 免费观看人在逋| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美zozozo另类| 国产一级毛片七仙女欲春2| 干丝袜人妻中文字幕| 美女黄网站色视频| 国产伦在线观看视频一区| 日韩高清综合在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜久久久久精精品| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产视频内射| 日日撸夜夜添| 国产成人一区二区在线| 亚洲最大成人手机在线| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲在线观看片| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 日韩欧美精品v在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 一夜夜www| 免费在线观看影片大全网站| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久久久国产a免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一进一出抽搐动态| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久视频播放| 国产男靠女视频免费网站| 九色国产91popny在线| av在线天堂中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久国产成人精品二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜精品在线福利| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品电影一区二区三区| 欧美成人a在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 最近中文字幕高清免费大全6 | 午夜老司机福利剧场| 国产精品福利在线免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 欧美激情在线99| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | a级毛片a级免费在线| 国产老妇女一区| 成人鲁丝片一二三区免费| 十八禁网站免费在线| 伦理电影大哥的女人| 国产美女午夜福利| avwww免费| 欧美高清成人免费视频www| 午夜福利视频1000在线观看| www日本黄色视频网| 午夜视频国产福利| a在线观看视频网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 免费人成在线观看视频色| 中亚洲国语对白在线视频| 日本与韩国留学比较| 国内精品久久久久精免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品人妻1区二区| 久久久精品大字幕| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 成人国产一区最新在线观看| av在线老鸭窝| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜福利在线在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 嫩草影院入口| 精品久久久久久,| 亚洲三级黄色毛片| 免费搜索国产男女视频| 国产三级在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久国内视频| 婷婷色综合大香蕉|