高效液相色譜法測定雙料喉風散中靛藍和靛玉紅含量

王婷婷，李 玲，陳乃江

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000）

雙料喉風散是由人工牛黃、青黛、黃連、珍珠、山豆根等9味中藥組方的中藥復方制劑，主要用于治療肺胃熱毒熾盛所致咽喉腫痛、口腔糜爛、齒齦腫痛、鼻竇膿腫、皮膚潰爛等癥［1］，收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑（第十六冊）》，現(xiàn)行質(zhì)量標準中的檢驗項目有性狀、理化鑒別和散劑檢查［1-2］，無具體成分的定量項，不能客觀地反映雙料喉風散的質(zhì)量。處方中青黛的主要活性成分為靛藍和靛玉紅［3］，為其主要有效成分，故被選為測定指標。本研究中參照文獻［4-6］，建立了測定雙料喉風散中靛藍和靛玉紅含量的高效液相色譜法，該方法操作簡便、準確，專屬性強，可有效控制該制劑質(zhì)量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Sartorius BP211D型電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（700 W，40 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；超純水儀（Milli-Q 公司）。

1.2 試藥

靛藍對照品（批號為 110716-201612，純度為98.7% ），靛玉紅對照品（批號為 110717-201805，純度為99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；雙料喉風散（市售，廣東嘉應制藥股份有限公司，批號分別為20170302，20170406，20171205，規(guī)格為 2.2 g）；乙酸銨為分析純，甲醇和DMF為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.02 mol/L 乙酸銨（75 ∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；檢測波長：289 nm。

2.2 溶液制備

避光操作。稱取靛玉紅對照品10.64 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置100mL棕色容量瓶中。稱取靛藍對照品11.31mg，精密稱定，置同一容量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品（批號為20170406）約0.5 g，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加DMF適量，超聲處理20 min，加DMF稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方取缺青黛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

圖1 雙料喉風散高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2項下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果，供試品溶液色譜圖中，靛藍色譜峰與相鄰色譜峰達到了基線分離，陰性對照品溶液在與靛藍峰、靛玉紅峰相同保留時間處無相應色譜峰，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液1，2，4，5，6，8，10 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻。依次進樣，記錄色譜圖，以對照品質(zhì)量濃度（，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，Y靛藍=60 183-25 168（r=0.999 9，n=7），Y靛玉紅=63 191-4 404.2（r=0.999 7，n=7）。結(jié)果表明，靛藍與靛玉紅質(zhì)量濃度分別在 4.52 ～45.20 μg/mL 和 0.426 ～4.260 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定。結(jié)果靛藍和靛玉紅峰面積的RSD分別為 0.71%和 0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液（批號為20170406），分別于 0，2，4，6，8，10，12 h 時進樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果靛藍和靛玉紅峰面積的RSD分別為1.12%，1.43%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：精密稱取同一批（批號為20170406）樣品，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，計算含量。結(jié)果靛藍和靛玉紅的平均含量分別為1.1090mg/g和0.1021mg/g，RSD分別為1.04%和1.36%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批樣品（批號為20170406）9份，分別置50 mL容量瓶中，每份0.5 g，精密稱定，3份1組，分別精密加入2.2項下混合對照品溶液4，5，6 mL。按供試品溶液制備方法制備溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL進樣測定，按擬訂色譜條件測定，用外標法計算樣品中靛藍和靛玉紅含量。結(jié)果見表2。

表2 雙料喉風散中靛藍和靛玉紅的含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

本研究中考察了氯仿、甲醇、DMF作為提取溶劑，超聲提取、加熱回流提取方法及20，30，40 min超聲提取時間對結(jié)果的影響，結(jié)果表明，采用DMF提取效率最高，超聲提取和回流提取所得靛藍和靛玉紅的含量接近，超聲提取的樣品雜質(zhì)峰相對較少，超聲提取20 min后測定值達到穩(wěn)定。因超聲提取比回流提取更簡便，故本研究采用DMF作為提取溶劑，超聲提取20 min。

通過DAD全波長掃描對照品溶液，發(fā)現(xiàn)靛藍、靛玉紅分別在285 nm和289 nm波長處有最大吸收。比較285 nm和289 nm波長下的色譜圖，在289 nm波長處樣品主成分峰與其余雜質(zhì)峰分離度好，干擾較少，靈敏度高，且樣品中靛玉紅的峰面積遠小于靛藍，故采用289 nm作為測定波長。

本研究中建立的高效液相色譜法可同時測定雙料喉風散中靛藍和靛玉紅的含量，且方法精密度、重復性、準確度均良好，可用于檢測不同批次的樣品，為更好地控制雙料喉風散的質(zhì)量提供了參考。