高通量測序技術(shù)在先天性腦積水基因診斷中的應(yīng)用

潘蕾，何志明，張銳

腦積水是一種常見但復(fù)雜的疾病，其是由腦脊液流動的物理或功能障礙引起的，每1 000例嬰兒中就有1.1例患有這種疾病[1-2]。腦積水按發(fā)病機(jī)制分為交通性腦積水和梗阻性腦積水。按病因分為由顱內(nèi)出血、宮內(nèi)感染等外在原因引起的繼發(fā)性腦積水和無明顯原因的原發(fā)性（先天性）腦積水；按照有無腦外主要臨床特征可分為綜合征性腦積水和非綜合征性腦積水[3]。遺傳性因素是先天性腦積水的重要病因，并在生育中存在較高的再發(fā)風(fēng)險，是臨床研究的重點。最常見的遺傳原因是與L1CAM基因相關(guān)的X連鎖腦積水，這只能解釋5%～10%的男性病例[4]。與其他類型的腦積水相比，非綜合征性先天性腦積水圍生期死亡率高，發(fā)病早、病情嚴(yán)重、預(yù)后差，約90%的存活嬰兒表現(xiàn)為神經(jīng)和身體殘疾[5]。這部分先天性腦積水無明顯外在致病因素，又缺乏腦外的臨床特點指導(dǎo)我們開展基因?qū)W檢查，所以病因診斷極其困難。隨基因檢測技術(shù)發(fā)展，已有越來越多基因被證實或懷疑與先天性腦積水有關(guān)[6-7]。但是全外顯子測序耗時長、成本高，實際難以應(yīng)用于臨床產(chǎn)前診斷，隨著二代測序法（next generation sequencing，NGS）的出現(xiàn)，醫(yī)生在臨床診療中自主設(shè)計針對先天性腦積水的基因面板成為可能。本研究從一個8例腦積水患者家系的臨床特點和遺傳規(guī)律出發(fā)，嘗試自主設(shè)計NGS基因面板，提高基因突變檢出率，以便為這些家庭提供可靠的咨詢和風(fēng)險評估。

1 資料與方法

咨詢者是來自深圳市寶安區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷門診的1例38歲孕婦（Ⅱ2），妊娠24周超聲提示胎兒（Ⅲ5）腦積水，前來就診。該孕婦共有5次妊娠史，第一次妊娠在孕20周因彩色超聲發(fā)現(xiàn)胎兒（Ⅲ1）腦積水引產(chǎn)一男嬰，第二次妊娠孕24周彩色超聲發(fā)現(xiàn)胎兒（Ⅲ2）腦積水，要求生育，孕足月“碎胎術(shù)”陰道娩出一男死嬰，未行任何基因檢查，隨后兩次妊娠均孕足月順產(chǎn)一女嬰，體健。腦積水家族史陽性，家系圖見圖1。Ⅱ11出生時頭圍大，出生后數(shù)天死亡。Ⅱ12出生時大拇指和食指并指內(nèi)收，3個月后發(fā)現(xiàn)腦積水，行外科手術(shù)治療后智力、行為接近正常，18歲時Ⅱ12失聯(lián)至今。胎兒Ⅲ7于孕20周彩色超聲發(fā)現(xiàn)重度腦積水，胎死宮內(nèi)。胎兒Ⅲ12和Ⅲ13均在孕中期結(jié)構(gòu)篩查超聲時發(fā)現(xiàn)腦積水而終止妊娠。胎兒（Ⅲ5）孕24周左右彩色超聲及磁共振成像（MRI）均提示重度腦積水，未發(fā)現(xiàn)其他伴發(fā)畸形，見圖2。

本例孕婦放棄胎兒，孕25周羊膜腔注射利凡諾終止妊娠，同時行羊水染色體核型、染色體微陣列分析，引產(chǎn)一男死嬰，頭圍約26 cm，雙側(cè)拇指內(nèi)收，見圖3（后插一）。取胎兒（Ⅲ5）皮膚組織按照標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany），完成單個受檢者的DNA建庫。自主設(shè)計包含L1CAM和AP1S2兩個目標(biāo)基因的基因面板，與受檢者DNA庫47 ℃雜交16～24 h，雜交結(jié)束后進(jìn)行洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進(jìn)行捕獲樣品的連接介導(dǎo)PCR反應(yīng)，最后利用高通量測序儀BGISEQ-500連續(xù)雙向測序50個循環(huán)，并讀出原始測序數(shù)據(jù)并行序列分析。對于發(fā)現(xiàn)的致病突變做Sanger測序，驗證基因芯片捕獲和高通量測序的結(jié)果。留取本例夫婦（Ⅱ1和Ⅱ2）、家系成員Ⅱ4和Ⅱ8外周血標(biāo)本行Sanger測序驗證，其余成員暫未參與檢測或驗證。

圖3 腦積水胎兒Ⅲ5引產(chǎn)后的大體特征

2 結(jié)果

胎兒（Ⅲ5）檢出L1CAM基因6號外顯子突變c.551G＞A（p.Arg184Gln），遺傳自母親（Ⅱ2），AP1S2基因未檢測到任何突變。后續(xù)家系成員Ⅱ4和Ⅱ8取外周血標(biāo)本行Sanger測序驗證均為該L1CAM基因突變攜帶者，見圖4（后插一）。

圖4 家系成員L1CAM基因檢測序列圖

3 討論

圖1 X連鎖腦積水家系圖

圖2 腦積水胎兒Ⅲ5的影像學(xué)結(jié)果

先天性腦積水是一種嚴(yán)重的出生缺陷，其遺傳學(xué)機(jī)制尚不清晰。相當(dāng)一部分的先天性腦積水是遺傳綜合征的其中一種表現(xiàn)，而非綜合征性的孤立性腦積水則較為罕見[8]。Tully等[3]綜述了非綜合征性先天性腦積水的4種表現(xiàn)形式及其相關(guān)基因，分別是X連鎖腦積水伴導(dǎo)水管狹窄（hydrocephalus due to stenosis of the aqueduct of Sylvius，HSAS）、弗里德綜合征（Fried syndrome）、肌肉－眼－腦病和嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳病，共涉及十余種基因。目前為止，共有4個基因與先天性腦積水關(guān)系密切，其中L1CAM和AP1S2基因突變可引起X連鎖隱性遺傳的先天性腦積水，而CCDC88C和MPDZ基因突變則引起常染色體隱性遺傳疾病[6]。本病例家系提示X連鎖隱性遺傳，故設(shè)計的基因面板只含有L1CAM和AP1S2兩個基因。L1CAM基因突變被認(rèn)為是先天性腦積水最主要的原因。L1CAM基因突變導(dǎo)致了一種X連鎖特征，稱為L1綜合征，其特點是腦積水、內(nèi)收拇指、胼胝體發(fā)育不全、痙攣性截癱和精神發(fā)育遲滯[9]。關(guān)于L1CAM基因檢出率、基因型－表型關(guān)系的報道只有3個大樣本研究。Finckh等[10]篩選出153例產(chǎn)前或臨床懷疑的X連鎖腦積水患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行L1CAM檢測，共發(fā)現(xiàn)46個致病突變，即檢出率30.1%，在102例L1綜合征家族史陰性病例中有16例（16/102，15.7%）檢出突變，家族史和L1病的典型臨床表現(xiàn)數(shù)目對突變檢出率有顯著影響。Adle-Biassette等[11]對138例L1CAM基因篩查標(biāo)本的神經(jīng)病理資料進(jìn)行回顧性分析，多達(dá)57例胎兒檢出L1CAM突變，在性別、腦積水、內(nèi)收拇指、Sylvius導(dǎo)水管狹窄、胼胝體異常和皮質(zhì)脊髓束異常6個主要臨床特征中，腦積水的陽性預(yù)測值最低44%，而內(nèi)收拇指的預(yù)測值最高74%。Vos等[12]的大樣本研究中內(nèi)收拇指也具有最好的陽性預(yù)測價值。本病例男性、腦積水、拇指內(nèi)收和多個家族成員受累這些臨床特征，與之前的研究相符合。由于導(dǎo)水管狹窄和胼胝體情況往往因腦積水重度壓迫而難以判斷或得不到明確診斷，我們認(rèn)為拇指內(nèi)收更可能作為預(yù)測突變的標(biāo)志。本次檢出突變位點6號外顯子c.551G＞A（p.Arg184Gln）在1994—2000年被報道過6次[13-18]，有3例表現(xiàn)為重度腦積水、1例拇指內(nèi)收，余2例未提及臨床表現(xiàn)而是從分子功能角度研究了該突變的致病機(jī)制，我們檢測到的基因型基本符合其臨床表型。

另一個可能導(dǎo)致X連鎖腦積水的基因是位于X染色體的AP1S2基因，可引起弗里德綜合征，首次描述于1972年[19]，主要特征是智力殘疾，通常伴有不同程度腦積水，如行CT掃描可見較明顯的鐵沉積，但產(chǎn)前與L1綜合征區(qū)別較困難，基因診斷可能是在產(chǎn)前診斷中鑒別兩者的主要手段[20]。

綜合征性先天性腦積水由于臨床特征明顯，腦外畸形的形式有助于識別特定的基因狀況，難度系數(shù)較小。但是對于非綜合征性的先天性腦積水，除了L1綜合征和弗里德綜合征，可能還涉及沃克/肌肉－眼－腦疾病、纖毛病和糖基化障礙。沃克/肌肉－眼－腦疾病主要結(jié)構(gòu)特征為腦積水，以及不同的眼部表現(xiàn)，包括微小丘腦炎、視神經(jīng)發(fā)育不良和前房畸形，涉及POMT1，POMT2，POMGNT1，F(xiàn)KTN，F(xiàn)KRP，LARGE，ISPD等7個常染色體隱性遺傳基因[3]。Shaheen等[6]收集先天性腦積水家系行全外顯子測序，在這些家族中發(fā)現(xiàn)了21種可能的致病突變，涉及16個基因，其中沒有一個是X連鎖的。纖毛病和糖基化障礙是這項研究中最常見的先天性腦積水的病因（分別為19%和26%），涉及EML1、WDR81、CCDC88C和MPDZ等十余個基因。非綜合征性先天性腦積水臨床特點隱匿，故難以縮小候選基因范圍，尤其對于發(fā)病例數(shù)少或者家族史陰性的病例，遺傳特點分析困難，存在確診時間長和漏診可能。對于產(chǎn)前診斷這一特殊情況，不僅孕周時限性強(qiáng)，而且胎兒超聲提供的臨床特點有限，如拇指內(nèi)收、智力障礙、痙攣性截癱、肌肉或眼病很難在胎兒期做出判斷，所以非綜合征性先天性腦積水產(chǎn)前基因診斷需開發(fā)新手段、提高效率。

本例病例在產(chǎn)前僅有腦積水表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)其他結(jié)構(gòu)畸形，所以在產(chǎn)前階段難以縮小候選基因的范圍，而逐個可疑基因進(jìn)行排查所需的時間和程序更久，漏診可能性更大。NGS以其通量高、總體成本低、信息產(chǎn)出高等突出優(yōu)點迅速發(fā)展，目前基于NGS的常用測序方法有Panel測序、外顯組測序和全基因組測序3種[21]，Panel測序可以由研究者自主設(shè)計較大的基因面板，相對價格適中、耗時短。NGS的應(yīng)用為獲得候選基因帶來了巨大的方便，符合產(chǎn)前診斷的時限性要求，未來可以更高效地應(yīng)用于先天性腦積水產(chǎn)前基因診斷。