間充質(zhì)干細(xì)胞分泌因子調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用

劉菡文，覃蓮菊，崔毓桂

氧化應(yīng)激（OS）是由于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）超過(guò)抗氧化反應(yīng)系統(tǒng)承受能力的一種現(xiàn)象。氧化應(yīng)激影響生殖系統(tǒng)，包括激素生成、卵母細(xì)胞的成熟、排卵、胚胎植入、黃體溶解和妊娠期黃體的維持[1]。卵泡液微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞等是ROS的重要來(lái)源，對(duì)卵巢有正面和負(fù)面的雙重影響，即卵巢內(nèi)適量的ROS能促進(jìn)非優(yōu)勢(shì)卵泡凋亡，也能促進(jìn)血管生成，增加卵巢內(nèi)血流，促進(jìn)卵泡破裂及排卵；但過(guò)多ROS積累會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)活性分子的結(jié)構(gòu)與功能，如DNA損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化和酶蛋白活性損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。過(guò)多ROS和氧化應(yīng)激與多種女性生殖疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）、多囊卵巢綜合征（PCOS）及不明原因不孕；還能導(dǎo)致復(fù)雜的病理妊娠，如自然流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期及胎兒生長(zhǎng)受限等[2-3]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵巢內(nèi)的細(xì)胞凋亡，也包括已排出的卵母細(xì)胞。卵巢組織和卵泡液中的ROS降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，降低排卵率、受精率、著床率以及活產(chǎn)率，即影響臨床妊娠結(jié)局；而抗氧化劑治療能降低ROS水平，降低氧化應(yīng)激介導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，有助于改善妊娠結(jié)局。

干細(xì)胞具有多向分化和自我更新能力。多種干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞（ESC）、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞，已被用于臨床細(xì)胞治療或臨床研究，而MSC相對(duì)于其他種類干細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因其來(lái)源豐富、易于獲得、低免疫原性且不存在倫理限制。研究表明，MSC治療能降低宿主組織細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，如移植人羊膜MSC能激活宿主細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路，減少細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生[4]；人絨毛膜MSC與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，能降低內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，提示MSC可作為炎癥性疾病的治療工具[5]。本文綜述MSC分泌因子的抗氧化應(yīng)激作用，闡述其可能的細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制。

1 氧化應(yīng)激與生殖疾病

ROS是在細(xì)胞代謝、氧氣消耗的關(guān)鍵過(guò)程中產(chǎn)生的一類具有高活性的小分子化合物，包括超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（HO-）等。細(xì)胞內(nèi)大部分ROS是由線粒體呼吸鏈產(chǎn)生；存在金屬離子時(shí)，也通過(guò)芬頓反應(yīng)（一種非酶促反應(yīng)）產(chǎn)生部分ROS[6]。

大多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展，伴隨著氧化應(yīng)激水平升高，如PCOS、卵巢儲(chǔ)備減少（DOR）和卵巢早衰（POF）、EMs等生殖內(nèi)分泌疾病。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的血清前列腺素酶活性增加，總氧化應(yīng)激水平和OS指數(shù)（總氧化劑與總抗氧化劑的比值）更高，且線粒體消耗O2減少、還原型谷胱甘肽（GSH）水平以及ROS產(chǎn)生增加；生理性高血糖使單核細(xì)胞ROS水平增加，激活腫瘤壞死因子α（TNF-α）及核因子-κB（NF-κB）表達(dá)。TNF-α具有拮抗胰島素的作用，除參與PCOS患者胰島素抵抗外，還參與卵巢細(xì)胞異常發(fā)育和多發(fā)性囊泡形成、慢性不排卵，導(dǎo)致不育[7]。

卵巢高ROS水平可能誘導(dǎo)線粒體DNA改變，使線粒體功能紊亂，氧化磷酸化功能受損，三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生減少，從而導(dǎo)致卵子生成受損、卵母細(xì)胞數(shù)量減少，與POF的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8]。

再如，EMs患者的腹腔液中鐵、鐵蛋白和鐵血紅蛋白水平增高，這些鐵離子參與芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS、誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腹膜間皮的局部破壞，增加異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附[9]。

2 MSC的分泌因子及其細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制

利用組織損傷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，移植MSC細(xì)胞或注射MSC培養(yǎng)上清，都可以顯著改善受損器官的功能，說(shuō)明MSC部分治療作用是通過(guò)其分泌的可溶性細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的[10]；除分泌因子外還包括細(xì)胞外囊泡、外泌體等[11]，這可能通過(guò)多種機(jī)制對(duì)受損組織發(fā)揮保護(hù)和促進(jìn)再生的作用[12]：抗纖維化和抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、促血管生成、增殖和分化以及免疫調(diào)節(jié)。MSC分泌多種細(xì)胞因子，其中白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-8、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）表達(dá)量較多，還包括TNF-α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、白血病抑制因子（LIF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等因子[13-14]。

2.1 MSC分泌因子在生殖系統(tǒng)中的作用 MSC分泌因子可通過(guò)多種途徑在生殖系統(tǒng)中產(chǎn)生多重作用。例如，IL-6作用于靶細(xì)胞，可通過(guò)酪氨酸蛋白激酶-轉(zhuǎn)錄激活因子3（JNK-STAT3）信號(hào)傳導(dǎo)通路提高胚胎植入效率[15]，而STAT3可促進(jìn)叉頭盒蛋白O1（FOXO1）和FOXO3a基因的表達(dá)，F(xiàn)OXO1和FOXO3a兩者具有升調(diào)節(jié)錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）表達(dá)的作用（參見(jiàn)圖1）[16]。再如，IL-8可能通過(guò)靶細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白1/酪氨酸蛋白激酶（NOD1/JNK）通路發(fā)揮作用，增加滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)蛻膜的侵襲力[17]；NOD1還啟動(dòng)MAPK依賴性基因的表達(dá)，MAPK在此具有激活Keap1-Nrf2-ARE通路的作用（后文詳述）[18]。

顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞存在受體p75及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激酶2型受體（NTRK2）。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可作用于顆粒細(xì)胞/卵丘細(xì)胞的受體p75和NTRK2，進(jìn)而促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞的體外成熟率和體外胚胎培養(yǎng)的囊胚形成率[19]。HGF作用于卵巢靶組織，可通過(guò)激活沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT）/FOXO1信號(hào)通路減少靶細(xì)胞的氧化應(yīng)激，改善自然衰老過(guò)程的卵巢功能[20]。TNF-α可激活靶組織細(xì)胞的磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶亞基p47及NF-κB亞基p65，誘導(dǎo)H2O2和其他超氧化物的產(chǎn)生[21]，增加ROS產(chǎn)生和氧化應(yīng)激。

實(shí)驗(yàn)研究表明，超表達(dá)VEGF可使細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路相關(guān)的磷酸化亞基p38表達(dá)增加，并因此減少細(xì)胞凋亡；相反，使用VEGF拮抗劑，可增加細(xì)胞凋亡[22]。LIF作用于靶細(xì)胞，增加Stat3與線粒體解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，因此增加UCP2 mRNA的表達(dá)，后者具有保護(hù)細(xì)胞免受ROS致凋亡的作用[23]。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MSC能分泌的外泌體發(fā)揮“遠(yuǎn)程”作用，這些外泌體可激活內(nèi)皮細(xì)胞中的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)靶器官的血管形成[24]。

MSC分泌因子在生殖系統(tǒng)的作用見(jiàn)圖1。

圖1 MSC分泌因子（部分）及其細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制的模式圖

2.2MSC分泌因子激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件（Keap1-Nrf2-ARE）通路參與抗氧化反應(yīng) 以Keap1-Nrf2-ARE通路為例，介紹MSC分泌因子抗氧化應(yīng)激的作用。生理?xiàng)l件下，氧化應(yīng)激水平增加伴隨著抗氧化反應(yīng)的增強(qiáng)。體內(nèi)具有抗氧化作用的酶主要有超氧化物歧化酶（SOD，有SOD1和SOD2型）、CAT、血紅素加氧酶1（Ho-1）和還原型谷胱甘肽（GSH）等[25]，這些酶參與谷胱甘肽合成、活性氧清除、異生物代謝和排出、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)分解過(guò)多的ROS降低了細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，從而維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)這些酶的生成主要受Keap1-Nrf2-ARE通路的調(diào)控。Nrf2是誘導(dǎo)細(xì)胞防御系統(tǒng)的主要調(diào)控因子，介導(dǎo)了100多個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)保護(hù)基因的表達(dá)，包括抗氧化酶、Ⅰ期和Ⅱ期解毒酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白酶體亞基、分子伴侶蛋白、生長(zhǎng)因子及其受體、以及一些核轉(zhuǎn)錄因子[26]。這些細(xì)胞保護(hù)因子，在其基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)均含有順式調(diào)節(jié)元件序列“ARE”，即5’-GTGACnnnGC-3’；Nrf2與ARE結(jié)合后，啟動(dòng)上述細(xì)胞保護(hù)因子的表達(dá)，諸如SOD等多種抗氧化酶。

Nrf2的活性受Keap1調(diào)控。在正常生理?xiàng)l件下，Keap1與Nrf2結(jié)合，使Nrf2泛素化；泛素化的Nrf2無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞保護(hù)因子表達(dá)下降；在低水平氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1被滅活，Nrf2的泛素化停止，Nrf2順利進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合（Nrf2因此被活化），同時(shí)新合成Nrf2積累，誘導(dǎo)一系列細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，激活抗氧化防御系統(tǒng)[27]。因此，“氧化應(yīng)激—抗氧化防御”處于動(dòng)態(tài)平衡之中。再如，氧化應(yīng)激可能破壞細(xì)胞自噬，即細(xì)胞清除自身受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊蛋白的能力受損，自噬相關(guān)蛋白p62積聚并將Keap1隔離，Keap1不再與Nrf2結(jié)合；與Keap1分離的Nrf2轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)一系列細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，激活抗氧化防御系統(tǒng)，建立“氧化應(yīng)激—抗氧化防御”再平衡[27]。細(xì)胞內(nèi)Keap1-Nrf2-ARE通路一旦受損，機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的能力會(huì)受很大影響。Nrf2敲除小鼠雖然發(fā)育正常，但易發(fā)生氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如化學(xué)性致癌[28]、急性化學(xué)性肺損傷（ALI）等[29]。

細(xì)胞內(nèi)有多條信號(hào)通路能激活Keap1-Nrf2-ARE從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK和PI3K/Akt信號(hào)可激活Nrf2-ARE通路，增強(qiáng)GSH、SOD、NADPH醌氧化還原酶1（NQO-1）的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[30]，見(jiàn)圖1。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，抑制炎癥過(guò)程的細(xì)胞凋亡。在口腔鱗狀細(xì)胞癌放射治療中，IL-6在組織中高表達(dá)。其促進(jìn)了下游分子STAT3的活化，上調(diào)細(xì)胞中p62與Keap1相互作用促進(jìn)Nrf2的活化；活化的Nrf2可促進(jìn)Nrf2依賴性的ROS清除因子Mn-SOD表達(dá)，減少ROS及超氧化物的數(shù)量，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并可減少放療后細(xì)胞雙鏈DNA斷裂數(shù)，抑制細(xì)胞凋亡，使口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞產(chǎn)生輻射抗性[31]。與IL-6類似，BDNF也通過(guò)Keap1-Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，BDNF能增強(qiáng)神經(jīng)元中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、SOD等抗氧化酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[32]；在小鼠大腦中，BDNF能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2-ARE通路，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，對(duì)鐵超載所致細(xì)胞毒性起保護(hù)作用[33]。MSC分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-6、IL-8、BDNF、VEGF等，但是對(duì)生殖系統(tǒng)中Nrf2-Keap1-ARE通路及其抗氧化應(yīng)激作用的研究很少，圖1所示大多基于其他系統(tǒng)和其他組織細(xì)胞的研究結(jié)果。

3 MSC在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用研究

MSC已應(yīng)用于多種疾病臨床治療或臨床研究。在生殖領(lǐng)域中，MSC通過(guò)其多向分化能力及其分泌的細(xì)胞因子改善許多生殖疾病的癥狀，如子宮內(nèi)膜粘連、PCOS、POF等生殖內(nèi)分泌疾病。筆者推論，MSCs分泌眾多細(xì)胞因子及其參與的抗氧化作用，是MSC治療多種生殖內(nèi)分泌疾病的共同機(jī)制之一。

3.1 MSC在子宮內(nèi)膜粘連疾病中的應(yīng)用 Asherman綜合征（AS）是由于子宮內(nèi)膜破壞導(dǎo)致宮頸或?qū)m腔內(nèi)膜粘連，患者可出現(xiàn)閉經(jīng)、少經(jīng)甚至不育，部分AS患者手術(shù)及激素治療后癥狀仍未改善。將子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（eMSCs）移植到AS模型大鼠，大鼠的生育能力顯著改善[34]，表明eMSC移植可作為治療AS的潛在治療手段。向子宮內(nèi)膜粘連模型大鼠體內(nèi)移植骨髓MSC，可使子宮內(nèi)膜增厚，腺體數(shù)目增多，纖維化面積減少[35]。MSC改善子宮內(nèi)膜條件，為胚胎種植和胚胎發(fā)育創(chuàng)造良好條件，這可能為那些子宮內(nèi)膜粘連導(dǎo)致胚胎反復(fù)種植失敗的患者提供新的治療手段。

3.2 MSC在PCOS中的應(yīng)用 給予PCOS模型大鼠體內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC），PCOS+BMMSCs組與PCOS組相比，血清卵泡刺激素（FSH）升高，而黃體生成激素（LH）及睪酮降低，改善PCOS模型鼠體內(nèi)激素水平；細(xì)胞總抗氧化能力（TAC）升高，而細(xì)胞丙二醛（MDA）水平及細(xì)胞凋亡率降低，降低了PCOS模型鼠細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平；卵巢內(nèi)形態(tài)健康的大型竇卵泡數(shù)、卵母細(xì)胞體積、透明帶厚度增加，而初級(jí)卵泡和竇前卵泡數(shù)減少，有利于PCOS模型鼠排卵[36]。另一項(xiàng)研究中，從PCOS模型小鼠取得未成熟卵，體外培養(yǎng)成熟（IVM）時(shí)添加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液，能顯著提高小鼠卵母細(xì)胞的質(zhì)成熟和核成熟，使核質(zhì)成熟趨于同步，因而提高IVM卵母細(xì)胞的受精率、卵裂率和囊胚形成率[14]。

3.3 MSC在POF疾病中的應(yīng)用 骨髓MSC能分泌多種生長(zhǎng)因子，包括VEGF、IGF-1和HGF。用紫杉醇處理大鼠建立POF模型，靜脈注射給予骨髓MSC，能改善卵巢微環(huán)境從而改善POF癥狀和卵泡形成[37]。體外實(shí)驗(yàn)中將卵巢組織與骨髓MSC共培養(yǎng)，MSC能上調(diào)卵巢組織的Bcl-2表達(dá)、減少生殖細(xì)胞凋亡，提升卵巢質(zhì)量[38]。體內(nèi)和體外的研究中，MSC均改善卵巢功能，可能通過(guò)MSC分泌因子改善卵巢微環(huán)境，但確切機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。

4 展望

實(shí)驗(yàn)研究和少量臨床研究均表明，MSC治療能改善卵巢功能減退、POF患者的卵巢功能和臨床妊娠結(jié)局，對(duì)于子宮內(nèi)膜粘連導(dǎo)致的反復(fù)種植失敗也有較好的治療作用。MSC分泌眾多細(xì)胞因子，如IL-6、BDNF可通過(guò)激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路減少氧化應(yīng)激水平；VEGF、IGF-1、HGF能上調(diào)Bcl-2，減少生殖細(xì)胞凋亡。但MSC的眾多細(xì)胞因子及其組合在體內(nèi)的作用機(jī)制仍需更多研究。本文介紹了MSC分泌因子的抗氧化應(yīng)激作用，為后續(xù)研究MSC的臨床治療應(yīng)用提供新思路。