二倍體馬鈴薯花粉離體萌發(fā)條件的篩選*

唐飛， 李富婷， 艾菊， 高蒙， 李云海， 李燦輝， 馬玲

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,馬鈴薯科學(xué)研究院，云南 昆明 650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為茄科茄屬(SolanumL.)一年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是世界第三大糧食作物[1-4]，其營養(yǎng)豐富，生長周期耗水量小，因此在偏遠(yuǎn)缺水地區(qū)也能產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益，是我國脫貧攻堅的助力產(chǎn)業(yè).由于四倍體馬鈴薯育種周期漫長且種薯繁殖是多代無性繁殖過程，易積累病毒[2]，而且種薯的脫毒、存貯和運輸成本高，因此二倍體實生種子育種逐漸被越來越多的育種工作者所關(guān)注[2-5,12].

花粉活性測定及離體萌發(fā)的研究對雄配子的生物學(xué)研究、提高雜交效率和親本利用率都具有重要意義[6].但當(dāng)前對花粉管體外萌發(fā)的研究大多是針對四倍體馬鈴薯展開的[7-10].由于遺傳背景不同等因素，四倍體和二倍體馬鈴薯的花粉管體外萌發(fā)的最適條件可能并不相同，研究將探索二倍體馬鈴薯體外花粉管萌發(fā)的最適條件，以期為二倍體馬鈴薯的雄配子生物學(xué)研究和雜交育種工作提供有益參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用二倍體馬鈴薯E 和34-28雜交后，挑選出花期早且開花數(shù)量多的單株E172，收獲E172的薯塊.將E172的薯塊種植于云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院實驗基地，栽培方式和田間管理均按照常規(guī)方式進(jìn)行.盛花期時在晴天上午十點到十一點之間收集新鮮花藥，裝入滅菌的2 mL離心管中，用錫箔紙包裹，置于冰盒中帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)操作.

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理及染色

采用2,3,5-三苯基四唑化氫(TTC)染色法[2]測定花粉活性.將收集的花藥用 70%的乙醇消毒后，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒后的尖頭鑷子從花蕾中剝離出花粉，將剝離的花粉放在已消毒的載玻片上，用 TTC染液染色15 min后在顯微鏡下觀察，觀察 3個不同的視野，記錄視野里總花粉數(shù)及染上色的花粉數(shù)，計算花粉活性.在顯微鏡下，經(jīng)TTC染液染色后，活性正常的花粉粒被染成紅色，大小均勻且飽滿，而無活性花粉粒為無色，癟粒.根據(jù)花粉活性檢測確定的高活性花粉將用于后續(xù)的花粉離體培養(yǎng).

1.2.2 花粉離體培養(yǎng)及萌發(fā)率的測定

經(jīng)花粉活性測定后，采集花粉活性高的花蕾，用70%的乙醇消毒后，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒的尖頭鑷子從花蕾中剝離出花藥，放在已高壓滅菌的濾紙上，用解剖針輕輕挑出花粉粒.Ca2+和硼酸是馬鈴薯花粉離體萌發(fā)的必要物質(zhì)，所以實驗以含0.05 g/L CaCl2、0.01%硼酸和0.05 g/L瓊脂的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，取5 mL基本液體培養(yǎng)基倒入90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，將花粉粒倒入培養(yǎng)基中充分混勻，在黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)試驗.培養(yǎng)結(jié)束后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，以視野內(nèi)清晰并且花粉管伸長的長度是否超過花粉粒直徑為花粉是否萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，每個重復(fù)隨機(jī)選取5個不同視野進(jìn)行計數(shù)，計算各個培養(yǎng)條件下的花粉平均萌發(fā)率.

1.2.3 花粉離體萌發(fā)最適培養(yǎng)基的篩選

(1)適宜溫度篩選：設(shè)置 22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃ 共5個培養(yǎng)溫度，其他培養(yǎng)條件不變，篩選出花粉離體萌發(fā)的適宜溫度.

(2)適宜蔗糖濃度篩選：以基本培養(yǎng)基為試驗對照，在基本培養(yǎng)基中分別加入13%、 15%、17%、19%和21 % 的蔗糖進(jìn)行試驗，在無光照的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，篩選出適宜花粉離體萌發(fā)的蔗糖濃度.

(3)適宜硼酸濃度篩選試驗：利用(1)和(2)篩選出的適宜蔗糖濃度和培養(yǎng)溫度，在培養(yǎng)基中分別加入 70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L和110 mg/L的硼酸作為試驗組，以培養(yǎng)基中不加硼酸為對照組，黑暗培養(yǎng)并篩選花粉離體萌發(fā)的適宜硼酸濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活性測定

TTC(2,3,5-三苯基四氮唑)是一種常用的氧化還原染料，當(dāng)TTC進(jìn)入到細(xì)胞后，會與活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶結(jié)合后接受游離的氫離子，最終由無色的氧化型化合物變成了紅色的還原型化合物，利用這個機(jī)理，就可判斷出二倍體馬鈴薯E172的花粉活性.紅色且飽滿的花粉具有活性，無色、黑色或不飽滿的花粉無活性.

A：活性正常的花粉粒；B：活性不正常的花粉粒

圖1TTC法檢測花粉活性

Fig.1TTC method for detecting pollen activity

2.2 不同培養(yǎng)溫度對二倍體馬鈴薯E172花粉離體萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)溫度對二倍體馬鈴薯E172花粉離體萌發(fā)的影響如表1所示.當(dāng)培養(yǎng)溫度為22 ℃～28 ℃時，隨著培養(yǎng)溫度的不斷升高，花粉離體萌發(fā)率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，但當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時，萌發(fā)率下降了6.51%.二倍體馬鈴薯花粉萌發(fā)在28 ℃時萌發(fā)率達(dá)到最大值65.12%，是22 ℃培養(yǎng)條件的2.44倍，因此以下試驗培養(yǎng)溫度均采用28 ℃.

表1 不同溫度處理的花粉萌發(fā)狀態(tài)

2.3 不同蔗糖濃度對二倍體馬鈴薯E172花粉萌發(fā)的影響

蔗糖在植物生長發(fā)育過程中不僅作為一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，而且在花粉萌發(fā)及花粉管細(xì)胞壁合成和伸長過程中發(fā)揮重要作用.在花粉離體培養(yǎng)過程中，蔗糖能提供足夠的碳源，并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，讓細(xì)胞保持膨脹狀態(tài)，為花粉粒萌發(fā)提供良好的胞外環(huán)境.如果培養(yǎng)基中蔗糖濃度偏低，花粉粒細(xì)胞吸水過多會導(dǎo)致胞內(nèi)外滲透壓不平衡，造成花粉細(xì)胞破裂；若蔗糖濃度偏高，會造成花粉細(xì)胞大量失水，影響花粉萌發(fā)和花粉管生長過程，最終導(dǎo)致花粉萌發(fā)率下降.

如表2所示，當(dāng)蔗糖濃度低于17%時，蔗糖濃度升高有助于二倍體馬鈴薯花粉粒萌發(fā)，當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為17%時，花粉萌發(fā)率達(dá)到70.97%.但當(dāng)蔗糖濃度高于17%后，花粉萌發(fā)率開始下降，說明17%的蔗糖濃度是最適花粉管萌發(fā)濃度.

表2 不同蔗糖濃度處理的花粉萌發(fā)狀態(tài)

A：0%； B：13%；C：15%；D：17%；E19%；F：21%

圖2不同蔗糖濃度花粉管萌發(fā)情況

Fig.2The conditions of pollen germination treated with different sucrose concentrations

2.4 硼酸濃度對二倍體馬鈴薯花粉萌發(fā)的影響

大量的研究表明,硼是花粉萌發(fā)和花粉管生長所必需的物質(zhì)[11-12]，硼不僅可增加糖的吸收、轉(zhuǎn)運和代謝，形成花粉管頂端生長依賴的 Ca2+濃度梯度，還會影響到一些關(guān)鍵酶的活性，進(jìn)而影響花粉管細(xì)胞壁的合成及延展性.

不同硼酸濃度對二倍體馬鈴薯花粉萌發(fā)的影響如表3所示，硼酸濃度為70-100 mg/L的范圍內(nèi)時，硼酸濃度的升高有助于二倍體馬鈴薯花粉粒萌發(fā).隨著硼酸濃度增加至110 mg/L時，花粉萌發(fā)率比100 mg/L時下降了12.41%.這說明適宜二倍體馬鈴薯花粉萌發(fā)的最適硼酸濃度為100 mg /L，花粉萌發(fā)率達(dá)到52.68%.

表3 不同濃度硼酸處理的花粉萌發(fā)狀態(tài)

A：0 mg/L;B：70 mg/L;C：80 mg/L;D：90 mg/L;E：100 mg/L;F：110 mg/L

3 討 論

當(dāng)前，衡量花粉生活力狀態(tài)主要是依據(jù)花粉活性和花粉萌發(fā)率兩個指標(biāo).花粉活性和花粉的離體萌發(fā)一方面受到自身遺傳和生長發(fā)育等內(nèi)部因素的影響；另一方面也受到了培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)溫度及光照等外部因素的影響[13-14].大量文獻(xiàn)報道了在不同植物花粉離體萌發(fā)過程中Ca2+、蔗糖、硼酸、溫度及各類生長激素等因素的作用[15-19].馬鈴薯花粉離體萌發(fā)和花粉管伸長只有在適宜的培養(yǎng)基組分濃度下才能進(jìn)行[20].二倍體馬鈴薯種質(zhì)資源豐富，不同品系的花粉生活力也存在較大的差異，且花粉活性受到花粉發(fā)育時期的影響，因此探究二倍體馬鈴薯花粉離體培養(yǎng)條件對于二倍體馬鈴薯雄配子體生物學(xué)研究具有重要意義.

正?；钚缘幕ǚ凼沁M(jìn)行花粉離體培養(yǎng)的前提條件.不同二倍體品系的馬鈴薯花粉活性有較大的差異，主要表現(xiàn)為花粉形態(tài)不同以及成熟周期不同，所以在同一時間內(nèi)，花粉活性不高的品系進(jìn)行體外萌發(fā)試驗時，萌發(fā)率也會受到影響.蔗糖和硼酸是二倍體馬鈴薯花粉萌發(fā)和花粉管生長所必需的，是花粉離體培養(yǎng)基的主要成分.研究發(fā)現(xiàn)，在28 ℃暗培養(yǎng)條件下，二倍體馬鈴薯E172的花粉體外萌發(fā)的最適硼酸濃度為 100 mg/L，最適蔗糖濃度為17%.這與吳旺澤[15]等研究的馬鈴薯花粉離體培養(yǎng)條件相似.

研究通過一系列試驗篩選出了適宜二倍體馬鈴薯E172的花粉體外萌發(fā)及生長所需的最適培養(yǎng)溫度及蔗糖和硼酸的濃度，研究結(jié)果可為針對二倍體馬鈴薯E172的雄配子體生物學(xué)研究提供有益參考.