馬鈴薯葉片發(fā)育畸形基因的遺傳分析*

張黎冬， 楊中敏， 唐蝶， 楊典， 李曉鳳， 祝光濤

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,馬鈴薯科學(xué)研究院，云南省馬鈴薯生物學(xué)重點實驗室，云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點實驗室，云南 昆明650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為茄科茄屬雙子葉一年生植物，適應(yīng)性強，分布范圍廣，是僅次于小麥和水稻的世界第三大糧食作物，同時它也是全球最重要的塊莖類作物[1].馬鈴薯營養(yǎng)豐富，含有大量的微量元素、蛋白質(zhì)、氨基酸、B族和C族維生素，具有人類“第二面包”的美譽[2].

光合作用將太陽能轉(zhuǎn)化為可供綠色植物代謝的碳能，光合產(chǎn)物代謝產(chǎn)生ATP提供其他代謝或者運輸所需的動能[3-4].葉片是最重要的光合作用場所，葉片發(fā)育體現(xiàn)了植物發(fā)育內(nèi)外部的動態(tài)變化過程[5].葉片(源)產(chǎn)生光合產(chǎn)物供給植物其他組織(庫)的能力是作物產(chǎn)量的主要決定因素[6].此外，馬鈴薯一些與結(jié)薯相關(guān)的信號分子也在葉中合成，通過莖傳遞到匍匐莖促進馬鈴薯塊莖的形成[3,7].

在馬鈴薯中，葉的光合能力受發(fā)育和環(huán)境控制[1].因而鑒定葉片發(fā)育的基因，對于解析葉片的發(fā)育過程以及合理調(diào)控植物的光合能力和產(chǎn)物具有重要的意義.研究以二倍體馬鈴薯為研究材料，構(gòu)建了一個與葉片發(fā)育相關(guān)的分離群體，相較于正常植株，突變植株呈現(xiàn)葉片發(fā)育畸形，硬化變厚，微黃，葉綠素積累不足等表型，同時整個植株明顯變小.研究結(jié)合混合群體分離分析(Bulked Segregant Analysis-seq，BSA-seq)以及indel分子標(biāo)記的篩選，將控制葉片發(fā)育畸形的基因縮小至400 kb的區(qū)間，同時結(jié)合基因組信息以及注釋信息篩選出一個候選基因.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CIP 701165(P1)為母本與課題組創(chuàng)制的親和材料E-172(P2)為父本進行雜交獲得F1群體，從F1中挑選單株與P1回交獲得BC1群體，BC1進行自交創(chuàng)制了BC1S1分離群體.BC1S1群體出現(xiàn)了正常葉片以及畸形葉片的分離，該群體則用于后期畸形葉片的遺傳分析和基因定位.

1.2 實驗方法

1.2.1 表型鑒定和混合群體分離分析

播種的二倍體馬鈴薯種子出苗后一個月便可觀察葉片的表型.從后代中挑選葉片正常和畸形的單株各20株，參考劉秀麗等的CTAB法分別提取葉片基因組[8]，晾干后加入含RNase酶的蒸餾水溶解核酸.測定每一份DNA的濃度，將正常葉片與畸形葉片的樣品分別吸取等量的DNA混合，送至北京諾和公司測序.數(shù)據(jù)測量完畢后，首先區(qū)分基因組的兩套單倍型.建立單倍型具體方法：將提取的親本BC1和BC1S1群體提取的DNA深度測序，深度為20×.將親本重測序reads比對到DM參考基因組上，提取雜合SNP位點構(gòu)成雜合SNP集，再將后代重測序的reads比對到參考基因組,并提取后代每個單株在親本雜合SNP位置的基因型，得到自交后代純合的區(qū)域，利用個體間純合區(qū)域進行延伸，獲得親本的兩套單倍型.

其次，以親本中的任一的一套單倍型作為參考序列，分別計算兩個極端池的基因型頻率并計算SNP-index及其差值Δ(SNP-index)，利用R語言對SNP-index和Δ(SNP-index)畫圖[9].具體操作為：使用bwa軟件將每個個體比對到DM參考基因組上，然后使用samtools比對得到的bam文件排序去重并提取變異位點，使用1 Mb為計算單位,100 kb為滑動窗口分別計算兩池的SNP-index，并計算兩者的差值Δ(SNP-index).利用R語言對SNP-index和Δ(SNP-index)畫圖，橫坐標(biāo)代表滑動窗口在染色體上的物理位置，縱坐標(biāo)代表SNP對應(yīng)的SNP-index和Δ(SNP-index).取全基因組Δ(SNP-index)的最高1%的窗口中的最小限值作為閾值.

1.2.2 DNA 提取以及精細(xì)定位

根據(jù)實驗室提取DNA的操作流程，使用八連排和U型板批量提取基因組.具體操作如下：將葉片放入八連排管中.加入鋼珠以及250 μL CTAB溶液，利用細(xì)胞破碎儀震蕩破碎組織.65 ℃水浴1 h后冰浴.待樣品溫度涼至室溫，于通風(fēng)櫥中加入等體積的氯仿抽提.4 000 rpm離心10 min，吸取140 μL上清轉(zhuǎn)移到0.4 mL U型板中并加入等體積的異丙醇，將樣品板置于 -20 ℃ 冰箱沉淀1 h.4 000 rpm離心10 min，棄上清加入200 μL 75%乙醇洗滌，室溫晾干，加入100 μL含RNase酶的蒸餾水，放入37 ℃培養(yǎng)箱1 h，溶解核酸并消化RNA.

結(jié)合混合群體分離分析結(jié)果，在初定位區(qū)間設(shè)計引物并進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選重組單株以進行候選基因的精細(xì)定位.分子標(biāo)記引物序列如表1，PCR體系為11 μL，5.5 μL Promega Mix混合液，4.1 μL H2O，正反向引物各0.2 μL，1 μL模板，PCR程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，16 ℃保存.聚丙烯酰胺凝膠電泳膠濃度為8%，根據(jù)PCR產(chǎn)物片段大小，跑膠時間為60～90 min.利用銀染法顯色，分析結(jié)果并統(tǒng)計重組單株.

1.3 數(shù)據(jù)分析

對于每一對引物所擴增出的PCR產(chǎn)物，以已知表型作為對照，將葉片發(fā)育畸形的記錄為“a”，與之對應(yīng)的等位基因記錄為“b”，雜合狀態(tài)記錄為“h”.

根據(jù)定位區(qū)間，結(jié)合馬鈴薯參考基因組DM的注釋信息，預(yù)測葉片發(fā)育畸形基因，并分析相關(guān)基因的表達(dá)量.

2 結(jié)果與分析

2018年春于云南英茂花卉公司實驗基地播種了F1分離群體2 000株.通過表型調(diào)查，1 489株植株葉片表型正常，511株植株葉片發(fā)育畸形(圖1A，圖1B).正常與畸形植株葉片的分離比為3∶1(χ2=0.318，P=0.57)，分離比符合孟德爾單基因控制性狀的分離比，表明此分離群體中葉片畸形的基因是由隱性單基因控制.

通過對馬鈴薯葉片發(fā)育正常池以及葉片發(fā)育畸形池進行測序，與馬鈴薯參考基因組DM比對找出SNPs，并計算所有SNP的SNP-index.根據(jù)葉片發(fā)育正常池以及葉片發(fā)育畸形池的SNP-index，計算兩個池的絕對差值Δ(SNP-index).以馬鈴薯染色體為橫坐標(biāo)，差值為縱坐標(biāo)作圖(圖1C)，在2號染色體末端出現(xiàn)了兩個明顯的峰值.根據(jù)此區(qū)間的SNP不平衡情況以及該性狀由單基因控制，選擇差值信號位點最大的位置進行后續(xù)的研究.選取Δ(SNP-index)> 0.5，將控制二倍體馬鈴薯葉片發(fā)育畸形的基因初步定位于36.06 Mb～48.24 Mb.

(A)左植株發(fā)育正常，右植株發(fā)育畸形.(B)葉片表型.正常植株正常生長，植株中部葉片呈綠色，葉片形狀為仄形；畸形植株生長速度降低，植株中部葉片泛黃，葉片形狀不規(guī)則，葉片硬化.(C)BSA-seq結(jié)果

圖1葉片表型及葉片突變體基因的初定位

Fig.1The phenotype and primary mapping of the abnormal leaf mutant

為了進一步獲得控制馬鈴薯葉片發(fā)育畸形的基因，利用indel-分子標(biāo)記的方法篩選初步定位區(qū)間的交換單株，以此縮短候選基因所在的區(qū)間.將葉片發(fā)育正常以及畸形池與親本比對，篩選出13對具有多態(tài)性的indel標(biāo)記 (表1).

表1 精細(xì)定位所用的分子標(biāo)記

圖2葉片發(fā)育基因主效位點的精細(xì)定位

Fig.2The fine mapping of major effects gene which regulates leaf development

經(jīng)過混合群體分離分析以及遺傳連鎖分析，將葉片發(fā)育畸形的基因縮小范圍至2號染色體37.630 Mb-38.031 Mb之間,間隔400 kb.結(jié)合馬鈴薯參考基因組的注釋信息，此區(qū)間存在36個基因(圖2)，其中在已公布的二倍體馬鈴薯品種DM和RH葉片中均表達(dá)的基因有16個(表2).

表2 候選基因表達(dá)量分析

在16個候選基因中，核糖體蛋白S15(PGSC0003DMG400007336)是核糖體組裝蛋白[10]；泛素蛋白連接酶(PGSC0003DMG401013630)修飾泛素蛋白，泛素蛋白和植物蛋白的半衰期及定位相關(guān)[11]；銅是植物生理活動必不可少的金屬元素[12]，在擬南芥的研究中表明銅轉(zhuǎn)運體(PGSC0003DMG400013653)作用于根的生長和花粉的發(fā)育[13]；Ctp 合酶(PGSC0003DMG400013634)催化CTP的合成[14]；C端鋅指結(jié)構(gòu)(PGSC0003DMG400013662)與甲基化修飾[15]和誘導(dǎo)細(xì)胞分化[16]相關(guān)；環(huán)指蛋白113A(PGSC0003DMG400013655)[17]和腺嘌呤糖基化酶(PGSC0003DMG400013631)[18]作用于DNA損傷修復(fù)；微染色體維持蛋白(PGSC0003DMG400013633)在真核生物DNA復(fù)制起始和延伸階段具有重要作用[19]；轉(zhuǎn)運蛋白Sec24(PGSC0003DMG401013636，PGSC0003DMG402013636)和其他轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合物參與細(xì)胞內(nèi)代謝物的運輸[20]；鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(PGSC0003DMG400013656)發(fā)現(xiàn)于平滑肌中[21]；谷氧還蛋白(PGSC0003DMG400013635)[22]和硫氧還蛋白還原酶(PGSC0003DMG400013638)[23]調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(PGSC0003DMG400013663)[24]可能通過氧化還原作用提高生物量的合成；絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PGSC0003DMG400013661)種類多樣，作用于細(xì)胞調(diào)控的各個方面[25].

研究中異常植株葉片發(fā)育畸形，顏色泛黃，可能和植物葉綠體發(fā)育相關(guān).排除以上15個候選基因，將三半乳糖基二酰甘油2蛋白基因(PGSC0003DMG400007324，ProteinTRIGALACTOSYLDIACYLGLYCEROL2，TGD2)作為最終候選基因，該基因影響植物質(zhì)體發(fā)育[26].根據(jù)參考基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，該基因在葉片中表達(dá)且表達(dá)量高于其他組織.

3 討 論

利用圖位克隆的方法篩選出一個控制馬鈴薯葉片發(fā)育的候選基因.從馬鈴薯表型觀察，畸形植株的葉片發(fā)育狀態(tài)不佳，葉片發(fā)黃，形狀不規(guī)則，硬質(zhì)化嚴(yán)重.葉綠體是植株進行光合作用的重要場所.葉綠體的數(shù)量和形態(tài)直接影響葉片的顏色.因此，與葉片葉綠體生物合成和發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變則會導(dǎo)致葉片失去綠色[1,27-28].

利用現(xiàn)有的群體數(shù)量，將控制馬鈴薯葉片發(fā)育的基因縮至范圍為400 kb的區(qū)間.結(jié)合參考基因組信息，此區(qū)間內(nèi)含有36個基因，包含12個未知功能基因.該區(qū)間有一個與質(zhì)體發(fā)育相關(guān)的基因三半乳糖基二酰甘油2 蛋白 (TDG2)，推測其為控制馬鈴薯葉片發(fā)育的候選基因.在模式植物擬南芥中共有四個TDG基因，主要參與脂質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到葉綠體的運輸[26,29].TDG1-TDG4這四個基因中任何一個基因的突變都會導(dǎo)致了三半乳糖基二酰甘油的積累(TGDG)[30].TDG2主要是通過其N端的跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)揮功能[31].衣藻TDG2的突變呈現(xiàn)早衰現(xiàn)象，與對照相比TDG2基因被突變的衣藻壽命明顯縮短，培養(yǎng)21天后，葉綠素含量降低，培養(yǎng)物變黃[32].

馬鈴薯葉片發(fā)育良好與否直接關(guān)系光合作用能力的強弱從而影響馬鈴薯產(chǎn)量高低.因而能夠構(gòu)建一個與馬鈴薯葉片發(fā)育相關(guān)的群體并且篩選候選基因?qū)︸R鈴薯育種具有重要意義.