噬菌體裂解酶作為抗菌劑的潛在價(jià)值

袁玉玉，叢聰，王麗麗,2,4，李曉宇,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院, 遼寧大連 116024；2 動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心，遼寧大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術(shù)公司, 遼寧大連 116620;4 遼寧省大連賽姆噬菌體應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600)

抗菌藥物耐藥性(Antimicrobial drug resistance，AMR)是全世界日益增長(zhǎng)的挑戰(zhàn)。新的抗性機(jī)制的出現(xiàn)及其通過(guò)縱向和橫向基因轉(zhuǎn)移的廣泛分布令人震驚。因此，多重耐藥(MDR)細(xì)菌正在全球傳播，且MDR細(xì)菌感染的全面影響仍然未知。噬菌體療法作為一項(xiàng)開(kāi)拓性的醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，在其基礎(chǔ)科學(xué)尚未得到初步了解之前就已經(jīng)開(kāi)始實(shí)施。因此，使用噬菌體作為治療藥物產(chǎn)生了許多問(wèn)題，尤其是由于對(duì)噬菌體生物學(xué)缺乏深刻的理解。特別是，與任何抗菌藥物治療一樣，關(guān)鍵是使用一些具有一定潛力的制劑，首先在體外，然后在體內(nèi)，作為靶向微生物的有效拮抗劑，并在其應(yīng)用中是安全的。噬菌體裂解酶是噬菌體感染宿主晚期表達(dá)的一類肽聚糖水解酶。噬菌體裂解酶作為治療制劑具有以下特點(diǎn)：(1)具有高度保守的種屬特異性，不會(huì)傷害機(jī)體細(xì)胞，也不干擾正常的菌群；(2)具有高效、快速的殺菌機(jī)制，可在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)菌；(3)不易產(chǎn)生抗性。裂解酶是一種蛋白質(zhì)分子，不易刺激細(xì)菌產(chǎn)生抗性。近年來(lái)建立的多種動(dòng)物感染模型，初步體現(xiàn)了裂解酶用于耐藥細(xì)菌感染治療的潛力與優(yōu)勢(shì)。本文將噬菌體裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了簡(jiǎn)要的介紹，重點(diǎn)綜述了裂解酶作用機(jī)制與應(yīng)用前景。

1 裂解酶結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制

針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的裂解酶結(jié)構(gòu)通常是有差異的，這反映了細(xì)菌群體之間的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異。來(lái)自革蘭陽(yáng)性菌的裂解酶已經(jīng)發(fā)展到利用模塊化設(shè)計(jì)，其中催化活性和底物識(shí)別被分別稱為細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cell wall binding domains，CBD)和酶促活性結(jié)構(gòu)域(enzymatically active domains，EAD)的兩種不同類型的功能結(jié)構(gòu)域[1,2,3]。EAD賦予酶的催化機(jī)制(即，裂解細(xì)菌肽聚糖內(nèi)的特異性鍵)，但有一些裂解酶的CBD能將蛋白質(zhì)靶向其底物，并在細(xì)胞裂解后保持其緊密結(jié)合到細(xì)胞壁碎片，從而阻止擴(kuò)散，以及破壞周圍尚未被噬菌體感染的完整細(xì)胞[4]。相比之下，革蘭陰性菌的外膜(outer membrane，OM)可以通過(guò)限制裂解酶從外部進(jìn)入肽聚糖層來(lái)防止這類附帶損害，這可能解釋了為什么來(lái)自感染革蘭陰性宿主的噬菌體的裂解酶主要是小的單域球狀蛋白(分子量在15到20 kDa之間)，通常沒(méi)有特定的CBD模塊[5]。與革蘭陽(yáng)性菌的裂解酶相比，這類裂解酶可能會(huì)更好地發(fā)揮酶的催化作用(輔助細(xì)胞裂解過(guò)程中的多個(gè)催化反應(yīng))，這類酶結(jié)合到一個(gè)位點(diǎn)會(huì)具有非常低的釋放率[6]。但也有例外情況，據(jù)報(bào)道，來(lái)自假單胞菌噬菌體(KZ144和EL188)的兩種革蘭陰性菌的裂解酶具有N末端CBD和C末端EAD的模塊化結(jié)構(gòu)。N端部分的KZ144以高親和力與銅綠假單胞菌細(xì)胞壁結(jié)合并識(shí)別其他革蘭陰性細(xì)菌的PG[7]。另一方面，金黃色陽(yáng)性的裂解酶主要具有相反的功能模塊取向，其中EAD位于N端，CBD在C端[8-10]。

2 裂解酶的安全性

從安全角度來(lái)看，裂解酶的高度特異性是其最有益的特性之一。特別是在食品安全和醫(yī)療應(yīng)用中，這些酶特異性地破壞目標(biāo)病原體而不影響共生菌群，這一事實(shí)使得它們比許多常用的抗生素或化學(xué)防腐劑更有優(yōu)勢(shì)。關(guān)于人或動(dòng)物體裂解酶的全身施用，主要關(guān)注的是釋放與細(xì)菌裂解有關(guān)的促炎細(xì)胞碎片如磷壁酸、脂磷壁酸和肽聚糖，這可能潛在地導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如感染性休克和多器官衰竭[11]。Entenza等發(fā)現(xiàn)通過(guò)連續(xù)靜脈輸注Cpl-1治療的小鼠中促炎性細(xì)胞因子濃度增加[12]。而Witzenrath及其同事報(bào)道，相同酶在12h內(nèi)間隔施用時(shí)，細(xì)胞因子濃度比未處理動(dòng)物低[13]。這兩個(gè)研究之間的差異可能是由于高濃度持續(xù)暴露于Cpl-1使細(xì)菌細(xì)胞壁碎裂增強(qiáng)，導(dǎo)致促炎性分子水平升高[14]。最后，由于它們的蛋白質(zhì)性質(zhì)，裂解酶是無(wú)腐蝕性和生物可降解的[15]。

3 裂解酶在醫(yī)藥方面的應(yīng)用

細(xì)菌可以定殖和感染人體任何部位。因此，裂解酶能夠到達(dá)感染部位是重要的。注射裂解酶已成為主要的施用途徑進(jìn)行應(yīng)用及研究。目前，有幾種類型的注射已被證明其在動(dòng)物模型中的功效：靜脈內(nèi)[16-18]、玻璃體內(nèi)[19]，腹膜內(nèi)[20-22]和腦池內(nèi)[23]。而且，SAL200和CF-301目前都在臨床上II期臨床試驗(yàn)(表1)注射[24]。注射主要是為了評(píng)估在動(dòng)物模型中治療全身性感染如腦膜炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎和菌血癥。P128是一種具有抗葡萄球菌活性的嵌合型酶，并已配制成水凝膠[25]。水凝膠由羥乙基纖維素、丙二醇和甘油組成。Abouhmad等[26]將T4裂解酶與纖維素融合模塊用于將裂解酶固定在纖維素紗布材料上，通常用于傷口敷料。融合蛋白保留了其抗革蘭陽(yáng)性菌的活性，同時(shí)不可逆地將裂解酶束縛于敷料紗布上。而且，固定化蛋白質(zhì)的含量更高、熱穩(wěn)定性更好和擱置壽命更長(zhǎng)。在一項(xiàng)后續(xù)研究，作者表明，固定的纖維素納米晶體上的T4裂解酶進(jìn)一步增強(qiáng)了抗血管生成作用和保質(zhì)期[27]。

表1 生產(chǎn)裂解酶的公司及臨床研究

4 裂解酶在食品安全中的應(yīng)用

許多研究已經(jīng)證明了噬菌體裂解酶用于控制和檢測(cè)食源性病原體的可能性。同樣，裂解酶優(yōu)于其他抗微生物的一大特性是它們對(duì)目標(biāo)病原體具有高度特異性，使食物的天然性和經(jīng)常需要的細(xì)菌菌群保持不變。一個(gè)明顯的控制策略是加入純化的裂解酶作為生物防腐劑的食品。Obeso及其同事發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌噬菌體裂解酶LysH5在巴氏消毒牛奶中迅速殺死金黃色葡萄球菌，在4h內(nèi)將細(xì)菌數(shù)量降至檢測(cè)水平以下[28]，并與細(xì)菌素乳酸鏈球菌素協(xié)同作用[29]。據(jù)報(bào)道裂解酶FCTP1在牛奶或奶制品中有活性[30]。一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是三種李斯特菌噬菌體裂解酶Ply118，Ply511和PlyP35具有高耐熱性，在90℃、30min后仍保持相當(dāng)大的裂解活性。這些熱穩(wěn)定酶可用于經(jīng)過(guò)熱處理的食品中，例如巴氏消毒奶制品[31]。噬菌體裂解酶也可在固體食物表面保持抗菌功效，研究顯示，將果實(shí)浸泡在產(chǎn)生歐文菌噬菌體裂解酶的大腸埃希菌細(xì)胞的裂解物中，能抑制梨上的解淀粉歐文菌的生長(zhǎng)[32]。

盡管在食品中的應(yīng)用尚未得到證實(shí)，但已經(jīng)有報(bào)道來(lái)自李斯特菌和梭菌噬菌體以及葡萄球菌裂解酶在檢測(cè)食品添加劑方面取得了重大進(jìn)展，使用高親和力的CBD作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的替代品[33-35]。Kretzer等研究表明，在食物中天然和人為污染與單核細(xì)胞增生李斯特菌相比，使用涂有李斯特菌噬菌體CBD的順磁珠，基于CBD的磁分離可以達(dá)到＞90%的檢出率[36]。證明該方法在靈敏度和時(shí)間要求方面優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)電鍍程序，并且也適用于檢測(cè)其他病原體，如蠟狀芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌。此外，有研究已經(jīng)證明了將這種高度靈敏的技術(shù)與實(shí)時(shí)PCR定量相結(jié)合的可能性[37]。將具有不同細(xì)胞壁特異性的8種不同的李斯特菌噬菌體裂解酶CBD與各種不同顏色的蛋白偶聯(lián)，建立了一套用于血清學(xué)菌株特異性對(duì)李斯特菌細(xì)胞進(jìn)行顯微檢測(cè)和分化的工具集[6]，該方法能夠區(qū)分不同的單核細(xì)胞增生李斯特菌。基于CBD的檢測(cè)方法也被報(bào)道用于炭疽桿菌[38,39]。在后者的研究中，裂解酶PlyG的C-末端區(qū)域得到的十氨基酸合成肽被證明能夠耦合到熒光QDOT?納米晶體，并足夠能應(yīng)變特異性檢測(cè)炭疽芽孢桿菌替代物。

5 展望

在過(guò)去5年中，關(guān)于噬菌體裂解酶文獻(xiàn)數(shù)量大幅度增加，這些酶在醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力也得到開(kāi)發(fā)。從醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，噬菌體裂解酶特別適用于局部應(yīng)用的治療方法，從而規(guī)避或減少與全身給藥相關(guān)的許多潛在風(fēng)險(xiǎn)。然而，最近涉及裂解酶治療動(dòng)物感染模型的研究提出裂解酶有望在長(zhǎng)期全身治療中成為抗生素的合適替代品。