ox-LDL誘導(dǎo)后SHP-2缺陷骨髓巨噬細(xì)胞脂肪沉積、吞噬功能及脂肪代謝基因表達(dá)觀察

梁雪雷，馬倩，李新新，譚鶴，張雪，帖彥清

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2河北省人民醫(yī)院)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)相關(guān)的冠心病和腦卒中發(fā)病率較高，絕大部分患者是由高脂血癥誘發(fā)的AS。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是高脂狀態(tài)下衍生的導(dǎo)致AS的主要和特異性誘導(dǎo)物[1]。巨噬細(xì)胞是參與AS的關(guān)鍵細(xì)胞，可被動(dòng)員、激活和趨化到AS部位，以清除動(dòng)脈上異常沉積的脂質(zhì)。然而，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞可通過(guò)吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而引起一系列的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速AS進(jìn)展[2]。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞是AS特有的、最多的細(xì)胞類型[3]。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2是維持眾多類型細(xì)胞功能的關(guān)鍵基因[4]。關(guān)于SHP-2是否參與泡沫細(xì)胞形成，目前相關(guān)研究很少。2016年11月～2019年3月,本課題組繁育了骨髓巨噬細(xì)胞(BMDM)特異性SHP-2基因缺陷背景基因穩(wěn)定型小鼠(SHP-2 MφCKO小鼠)，觀察了ox-LDL誘導(dǎo)后SHP-2 MφCKO小鼠BMDM脂肪沉積、吞噬功能及脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討SHP-2影響巨噬細(xì)胞脂代謝的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物：SHP-2flox/flox小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，雌雄各8只，鼠齡4～6周；Lyz-2-Cre小鼠(利用Lyz-2啟動(dòng)子構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠，能使83%～98%的成熟巨噬細(xì)胞發(fā)生基因重組)由路永剛博士贈(zèng)與，雌雄各20只，鼠齡4～6周。主要實(shí)驗(yàn)材料：胎牛血清(FBS,以色列BI公司)、Dil-ox-LDL(廣州奕源生物科技有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、單分散熒光微球(聚苯乙烯微球，Polysciences公司)、Gluta固定液(電鏡專用，4%，北京索萊寶科技有限公司)、快速DNA提取檢測(cè)試劑盒(KG203，北京天根生化科技有限公司)。

1.2 SHP-2 MφCKO小鼠的繁育與鑒定

1.2.1 SHP-2 MφCKO小鼠的繁育 將SHP-2flox/flox雌鼠與雄鼠一起合籠，順利繁育出F1代子鼠。用Lyz-2-Cre小鼠與F1代SHP-2flox/flox小鼠合籠，對(duì)得到的F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，篩選基因型為Cre×SHP-2flox/+的雜合子小鼠。將基因型為Cre×SHP-2flox/+的雜合子雌雄鼠合籠繼續(xù)繁殖，得到F3代小鼠，經(jīng)鑒定篩選得到基因型為Cre×SHP-2flox/flox的小鼠即為實(shí)驗(yàn)需要的純合子小鼠(SHP-2 MφCKO小鼠)[5,6]。

1.2.2 SHP-2 MφCKO小鼠的鑒定 取4～6周齡SHP-2 MφCKO小鼠，剪3 mm左右尾巴尖部，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SHP-2的loxp位點(diǎn)上游引物序列為5′-ATGACTCCTGAAGCCCATTG-3′，下游引物序列為5′-CTTCCCATCACCTCAGACTCC-3′；Lyz-2-Cre基因突變型引物序列為5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′，野生型為5′-TTACAGTCGGCCAGGCTGAC-3′，共有引物為5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′。PCR反應(yīng)體系包括DreamTaq Green PCR Master Mix(2×) 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、去核酶水10 μL。反應(yīng)條件：初始變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 18 s(SHP-2flox/flox)或42 s(Lys-2-Cre-/+)，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 60 s。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存，后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖700 bp處有條帶為Cre+小鼠，350 bp處有條帶為Cre-小鼠；僅320 bp處有條帶為SHP-2flox純合子小鼠(SHP-2flox/flox)即SHP-2 MφCKO小鼠，只有221 bp處有條帶為野生型小鼠(SHP-2+/+)，320 bp、221 bp處均有條帶為雜合子小鼠(SHP-2flox/+)。

1.3 動(dòng)物分組、BMDM獲取及ox-LDL刺激方法 選取8～10周齡的雄性SHP-2 MφCKO小鼠(實(shí)驗(yàn)組)和野生型小鼠(基因型SHP-2+/+，對(duì)照組)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠引頸處死，浸泡在75%乙醇中消毒5 min，在超凈臺(tái)中暴露并分離小鼠股骨及脛骨，置于冰的PBS培養(yǎng)皿中。剝離肌肉組織，切除關(guān)節(jié)面，暴露骨髓腔，用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗出來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)基懸液，1 000 r/min離心5 min。丟棄上清液，換含10% FBS、1%雙抗、50 ng/mL M-CSF的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后鋪至T25培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。將貼壁5 d后的BMDM用0.25%胰酶消化，加入含2% FBS的完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液備用。在新的6孔板各孔中央滴加300 μL的含2% FBS的完全培養(yǎng)基，用鑷子夾取無(wú)菌爬片，輕放于培養(yǎng)基上并按壓爬片使其不易浮起，在爬片上滴加500 μL的細(xì)胞懸液，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，使細(xì)胞貼壁。每孔補(bǔ)加1 200 μL的含2% FBS完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。8 h后每孔加0.25 μL的ox-LDL(終濃度為50 ng/mL)[7]。

1.4 BMDM脂滴沉積觀察 兩組BMDM用50 ng/mL的ox-LDL刺激48 h后，使用電鏡灌流固定液固定細(xì)胞，透射電鏡下觀察BMDM脂滴沉積情況。將BMDM與100 mg/L的Dil-ox-LDL(紅色熒光)共同孵育48 h后，用熒光顯微鏡照相，觀察泡沫細(xì)胞形成情況。

1.5 BMDM吞噬功能檢測(cè) 以ox-LDL刺激兩組BMDM的同時(shí)加入單分散綠色熒光聚苯乙烯微球1 μL(終濃度為0.5 μL/mL)，繼續(xù)孵育24 h后將爬片封片。使用激光共聚焦顯微鏡在488 nm處觀察BMDM對(duì)單分散熒光微球的吞噬情況，使用活細(xì)胞工作站檢測(cè)熒光強(qiáng)度，表示BMDM的吞噬功能。

1.6 BMDM中脂肪代謝相關(guān)基因檢測(cè) ox-LDL刺激24 h后提取兩組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系20 μL，包括TB GreenPremix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，上游引物和下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，去核酶水6.4 μL。CD36上游引物序列為5′-TCATGCCAGTCGGAGACATGCTTA-3′，下游引物序列為5′-ACCTGTCTGTACACAGTGGTGCCT-3′。Toll樣受體(TLR)4上游引物序列為5′-TGAACGAGAGGATGCTGACTG-3′，下游引物序列為5′-GGAGGGGCCATTTTTAGTGC-3′。甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(SREBP)-1c上游引物序列為5′-GGAGCCATGGATTGCACATT-3′，下游引物序列為5′-ACGGACGGGTACATCTTTAC-3′。SREBP-2上游引物序列為5′-CACAATATCATTGAAAAGCGCTACC-3′，下游引物序列為5′-TTTTTCTGATTGGCCAGCTTCAGCA-3′。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)上游引物序列為5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′，下游引物序列為5′-TTCCCGGAAACGCAAGTC-3′。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1)上游引物序列為5′-AGGTCTCAGCCTTCTAAAGTTCCTC-3′，下游引物序列為5′-TCTCTCGAAGTGAATGAAATTTATCG-3′。內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′，下游引物序列為5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 SHP-2 MφCKO小鼠的繁育及鑒定結(jié)果 繁育出Cre-小鼠36只，SHP-2 MφCKO小鼠53只，SHP-2+/+小鼠61只，SHP-2flox/+小鼠69只。不同小鼠基因型PCR鑒定情況見(jiàn)圖1。

注：A為Cre-小鼠；B為SHP-2 Cre+小鼠；C為SHP-2flox/+小鼠；D為SHP-2+/+小鼠。

圖1 小鼠基因型PCR鑒定情況

2.2 兩組小鼠BMDM中脂肪沉積情況比較 實(shí)驗(yàn)組小鼠BMDM中脂滴成分量多、體積大，基本充滿細(xì)胞質(zhì)，對(duì)照組BMDM中脂滴量少，體積小而且零散分散于細(xì)胞質(zhì)中，見(jiàn)圖2。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的紅色熒光顆粒(脂滴)，提示已經(jīng)形成泡沫細(xì)胞，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組BMDM中紅色熒光含量分別為1.93±0.27、0.83±0.03，兩組相比，P<0.05。

2.3 兩組BMDM吞噬功能比較 激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組BMDM細(xì)胞內(nèi)熒光微球的數(shù)量顯著增加(圖4)。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組BMDM內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度分別為1 297±17.14、454.5±24.75，兩組相比，P<0.05。

2.4 兩組BMDM中脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)比較

注：a為1 000×；b為3 000×。

圖2透射電鏡下兩組BMDM中脂滴沉積情況

注：a為明場(chǎng)視野；b為熒光視野。

圖3 熒光顯微鏡下兩組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色熒光顆粒情況

圖4 激光共聚焦顯微鏡下兩組BMDM內(nèi)熒光微球數(shù)量

實(shí)驗(yàn)組BMDM中CD36、TLR-4、SREBP-1c和SREBP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組BMDM中脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

ox-LDL是高脂狀態(tài)下衍生的誘發(fā)AS的主要物質(zhì)[1]。在AS進(jìn)程中，循環(huán)中的單核-巨噬細(xì)胞首先被動(dòng)員、激活和趨化到病變部位以清除動(dòng)脈上異常沉積的脂質(zhì)。巨噬細(xì)胞表達(dá)多種清道夫受體(SR)，主要負(fù)責(zé)吞噬修飾后的脂質(zhì)如ox-LDL和乙?；兔芏戎鞍?，這是識(shí)別、吞噬脂蛋白及其攜帶的膽固醇成分的第一步，也是促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。進(jìn)入巨噬細(xì)胞的多余脂質(zhì)和膽固醇成分激活SREBP[8]后，使巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積在胞質(zhì)內(nèi)形成巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞。多余的脂質(zhì)聚集后激活膽固醇外排蛋白ABCA1、ABCG1，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇酯和磷脂排出，結(jié)合細(xì)胞表面的載脂蛋白(Apo)A-I，最后通過(guò)HDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝[9]。

酪氨酸磷酸酶和激酶之間的平衡是維持細(xì)胞正常功能的支柱系統(tǒng)[10]，該系統(tǒng)失衡會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過(guò)度、代謝失衡、免疫異常直至腫瘤等疾病[11]。最近研究顯示，巨噬細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶(SYK)升高可明顯促進(jìn)膜表面CD36內(nèi)化和CD36/TLR-4/TLR-6異源三聚體形成。SHP-2與SYK、布魯頓酪氨酸激酶(BTK)等的作用相互制約、拮抗且互為底物。圍繞SHP-2是否參與泡沫細(xì)胞形成這一課題，我們經(jīng)過(guò)4年努力成功構(gòu)建了SHP-2 MφCKO小鼠，而且由于SHP-2flox/flox和Lyz-M Cre小鼠背景不同，我們通過(guò)純化9代使所有子代小鼠基因型穩(wěn)定，而后用ox-LDL刺激小鼠BMDM以便于研究SHP-2在巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中的作用。ox-LDL是促進(jìn)AS的關(guān)鍵因子，由于受體識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)型改變，所以只能被巨噬細(xì)胞表面的SR和TLR家族識(shí)別，不能被肝臟細(xì)胞的LDL受體識(shí)別。ox-LDL攜帶大量膽固醇，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列代謝后形成大量膽固醇酯以脂滴形式儲(chǔ)存在胞內(nèi)，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞[12]。我們將BMDM饑餓處理8 h后給予50 ng/mL的ox-LDL和熒光微球共刺激24 h，分別檢測(cè)了BMDM吞噬熒光微球的熒光強(qiáng)度和數(shù)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴和吞噬熒光微球的數(shù)量多于對(duì)照組，提示SHP-2基因缺陷明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成，巨噬細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)一步提高[13]。

CD36是巨噬細(xì)胞表面的重要SR-A家族受體，也是單核-巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL的主要受體[14]。CD36可以無(wú)限制地吞噬或攝取修飾后的LDL，而且不受負(fù)反饋抑制，造成細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯聚集最終形成泡沫細(xì)胞[15]。TLR-4也是ox-LDL受體，而且它與CD36關(guān)系密切，參與了CD36-TLR-4/TLR-6異源三聚體形成和內(nèi)化ox-LDL[16]。因此，我們同時(shí)檢測(cè)了兩組BMDM中的CD36、TLR-4 mRNA，結(jié)果顯示，經(jīng)50 ng/mL的ox-LDL刺激后，實(shí)驗(yàn)組CD36、TLR-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示BMDM吞噬能力明顯增強(qiáng)。SREBP家族是核轉(zhuǎn)錄因子，它能與脂質(zhì)合酶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，特異性調(diào)控膽固醇攝入及合成代謝[17]。目前，已知SREBP-1主要調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶或硬脂酰輔酶A脫氫酶等下游基因轉(zhuǎn)錄合成，調(diào)控脂肪酸合成。SREBP-2通過(guò)調(diào)節(jié)β-羥基-β-甲戊二酸單酰輔酶A脫氫酶合酶及還原酶和低密度脂蛋白受體等的合成，從而調(diào)控膽固醇代謝。SREBP-1c和SREBP-2基因表達(dá)異常可導(dǎo)致二者調(diào)節(jié)平衡失調(diào)，可導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)、膽固醇大量沉積，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。本研究結(jié)果顯示，SHP-2基因缺陷后SREBP過(guò)表達(dá)，提示膽固醇在胞內(nèi)“消化”和“儲(chǔ)存”增強(qiáng)。巨噬細(xì)胞主要通過(guò)ABCA1和ABCG1將細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出至HDL后到達(dá)肝臟代謝[18,19]，但本研究發(fā)現(xiàn)兩組ABCA1、ABCG1 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SHP-2基因缺陷并未影響ABCA1、ABCG1 mRNA的表達(dá)，提示SHP-2基因缺陷加速泡沫細(xì)胞形成可能與增強(qiáng)ox-LDL內(nèi)化進(jìn)入巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)膽固醇或脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[20]。

總之，本研究證實(shí)，SHP-2基因缺陷小鼠BMDM脂肪沉積加劇，細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)，脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。SHP-2基因缺陷的BMDM可能通過(guò)促進(jìn)吞噬ox-LDL并使其轉(zhuǎn)化為膽固醇酯等儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，從而促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成。檢測(cè)AS患者單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)的SHP-2蛋白可能有助于評(píng)估AS的進(jìn)展。