胰酶提升小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性工藝及其功能特性研究

闕 斐，趙 粼，陳錫威

（1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江杭州310018；2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州310000）

小麥蛋白粉是生產(chǎn)小麥淀粉時(shí)的副產(chǎn)品，含人體必需的十五種氨基酸，是一種營養(yǎng)豐富的植物蛋白源，但含有較多的疏水性氨基酸和不帶電荷的氨基酸，溶解度較低，不能滿足加工的需要，應(yīng)用受到限制。目前，由于反應(yīng)條件溫和、可控性強(qiáng)、能耗低、安全天然等優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用酶水解改性小麥蛋白粉已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)，張影陸[1]、Xiangzhen Kong[2]、張銳昌[3]、齊軍茹等[4]研究了胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等單酶對小麥蛋白進(jìn)行改性的效果，而孫麗平[5]、唐勝[6]、林敏剛等[7]研究了堿性蛋白酶和風(fēng)味酶、米曲霉生長產(chǎn)生的復(fù)合酶對小麥蛋白進(jìn)行改性的效果，改性后的小麥蛋白由于分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使酶解產(chǎn)物的水溶性、乳化性、起泡性、吸水性、粘彈性等功能性質(zhì)產(chǎn)生較大變化，因此酶解物可作為食品添加劑、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料添加劑進(jìn)行開發(fā)，拓寬了小麥蛋白的應(yīng)用范圍。其中堿性酶、胰酶等，由于可以在堿性條件下較大程度地水解小麥蛋白，產(chǎn)生明顯的改性效果，因此是研究重點(diǎn)，但是目前的報(bào)道中，系統(tǒng)的工藝研究與功能特性研究相結(jié)合的報(bào)道較少。本文以乳化活力為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)，較為系統(tǒng)地研究了胰酶水解小麥蛋白的工藝條件，隨后研究了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性、分子量分布、氨基酸組成等功能特性，結(jié)果可為小麥蛋白深加工開發(fā)與工業(yè)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥蛋白粉 購自徐州澳凱小麥淀粉有限公司；胰酶 購自廣西龐博生物工程有限公司；純花生油 購自山東魯花集團(tuán)有限公司；DPPH自由基、Ferrozine試劑、AA-S-18氨基酸混標(biāo) Sigma公司；其他試劑 均為分析純與色譜純。

HH-4型水浴鍋 國華電器有限公司；T6系列紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pHS-25B型酸度計(jì) 上海大中分析儀器廠；90-1型恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠；600型高效液相色譜儀 Waters公司，配2487紫外檢測器和Empower工作站帶GPC軟件；TSK系列凝膠色譜柱（G2500PWXL 7.8mm×300mm）；C18柱（4.6mm×250mm，5μm） Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胰酶活力測定 采用GB/T 23527-2009蛋白酶制劑附錄B福林法。

1.2.2 原始小麥蛋白粉粗蛋白含量測定 采用GB 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測定中的凱氏定氮法進(jìn)行。

1.2.3 胰酶水解小麥蛋白的工藝流程 適量的蒸餾水→在一定溫度的水浴鍋中保溫→加入一定量的小麥蛋白粉（底物濃度5%）并攪拌→調(diào)節(jié)溶液的pH于設(shè)定的條件→加入適量的胰蛋白酶進(jìn)行酶解→用1moL/L的NaOH保持溶液的pH不變→攪拌酶解2h→立即在95℃條件下滅酶10min→酶解液。

1.2.4 胰酶水解小麥蛋白工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依次改變酶解pH、溫度、E/S（酶濃度，即酶與底物比），以酶解產(chǎn)物乳化活力指數(shù)作為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

稱取5g小麥蛋白粉于95mL的蒸餾水中，按照固定條件加入胰酶0.05g，水浴溫度為50℃，調(diào)節(jié)酶解pH分別為pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。

稱取5g小麥蛋白粉于95mL的蒸餾水中，按照固定條件加入胰酶0.05g，并調(diào)pH至8.5，分別于35、40、45、50、55℃水浴中進(jìn)行反應(yīng)。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

稱取5g小麥蛋白粉于95mL的蒸餾水中，按固定條件調(diào)pH至8.5，水浴溫度為50℃，分別加入胰酶0.05、0.15、0.25、0.35、0.45g，使酶濃度分別為1%、3%、5%、 7%、9%進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以乳化活力指數(shù)為指標(biāo)，水解度為參考，采取L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平表如表1。

1.2.5 小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化性能測定[8]取45mL蛋白質(zhì)濃度為0.1%的小麥蛋白酶解溶液（用0.2mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋），加入15mL純正花生油，在10000r/min、室溫下攪拌1min，分別在攪拌0、5、10min后從底部取樣。以0.1%（W/V）SDS（十二烷基硫酸鈉）稀釋100倍，測定500nm處的吸光值A(chǔ)500，以SDS溶液為空白。乳化性能由乳化活力指數(shù)EAI表示，計(jì)算公式如下：

式中，EAI：乳化活力指數(shù)，即每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2/g；N：稀釋倍數(shù)；Ф：油相所占的分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)中油相占1/4；L：比色池光徑，1cm；C：蛋白質(zhì)的濃度，g/mL。

1.2.6 小麥蛋白水解度的測定 水解度（DH）測定采用pH-stat法[9]，計(jì)算方法如下：

式中，VNaOH為消耗堿液的體積（mL）；NNaOH為消耗堿液的摩爾濃度（mol/L）；а為氨基酸的解離常數(shù)；Mp為參加水解的蛋白質(zhì)總量（g）；Htot為1g原料蛋白質(zhì)中肽鍵的mmol數(shù)，小麥蛋白取9.2。

1.2.7 清除DPPH自由基能力測定 清除DPPH自由基使用的是Que等的方法[10]。取50、100、200μL正交優(yōu)化工藝所得的小麥蛋白酶解液，用蒸餾水補(bǔ)充為2mL，分別加入2mL 0.1mmol/L的DPPH自由基醇溶液加入。室溫放置30min，于517nm處測定吸光值。用VC作為陽性對照，濃度為1mg/mL。根據(jù)下式計(jì)算清除率：

式中，A0：空白在517nm處吸光值；A1：樣品在517nm處吸光值。

1.2.8 金屬螯合能力測定 金屬鰲合能力使用Que等的方法進(jìn)行測定[10]。一些金屬離子在脂質(zhì)氧化過程中起催化作用，如鐵離子、銅離子等，因此具有對這些金屬鰲合作用的物質(zhì)可以間接地起到抗氧化的作用。Ferrozine試劑能夠與脂質(zhì)氧化催化劑Fe2+形成為紫紅色絡(luò)合物，當(dāng)其他有競爭力的絡(luò)和劑存在時(shí)，紫紅色會(huì)變淺。因此通過絡(luò)和物顏色的變化，可以評價(jià)物質(zhì)對Fe2+螯合能力，從而評價(jià)該物質(zhì)的抗氧化能力。取200、500、1000μL的正交優(yōu)化工藝所得的小麥蛋白酶解液，用蒸餾水補(bǔ)充為4.7mL，分別加入0.1mL 2mmol/L的FeCl2和0.2mL 5mmol/L Ferrozine。然后放置于室溫20min，于562nm測定吸光值。用濃度為1mg/mL EDTA和檸檬酸作為陽性對照。螯合能力用下式進(jìn)行計(jì)算：

式中，A0：空白在562nm處吸光值；A1：樣品在562nm處吸光值。

1.2.9 小麥蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布 采用GBT 22729-2008海洋魚低聚肽附錄A高效凝膠過濾色譜法測定正交優(yōu)化工藝所得的小麥蛋白酶解液中蛋白質(zhì)分子量的分布。

1.2.10 小麥蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸組成 正交優(yōu)化工藝所得的小麥蛋白酶解液中氨基酸組成用呂艷等[11]的方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶活力測定

測得實(shí)驗(yàn)所用的胰酶酶活為1657.43U/g。

2.2 原始小麥蛋白粉的基本數(shù)據(jù)

測得實(shí)驗(yàn)所用原始小麥蛋白粉中粗蛋白含量為75.23%、EAI值為5.27m2/g。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 pH對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性的影響 pH對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性的影響結(jié)果如圖1所示。在pH在7.5～9.5時(shí)，小麥蛋白酶解產(chǎn)物的乳化活力指數(shù)先增后減。這可能是因?yàn)楫?dāng)pH增大時(shí)，由于羥基作用使蛋白質(zhì)中羧基的暴露增多，從而增加了分子間的靜電斥力，使離散雙電層增加，溶液界面膜增厚，提高了乳化性；同時(shí)，酶活增加，反應(yīng)速率加快，同樣提高了其乳化性。但是隨pH繼續(xù)增大，酶水解的質(zhì)子化和去質(zhì)子化受pH影響較大，從而影響酶對小麥蛋白水解，乳化性下降[12]。因此正交實(shí)驗(yàn)選取了pH7.5～9.0作為研究水平。

圖1 pH對酶解液乳化活力指數(shù)的影響Fig.1 Influence of pH on the EAI of the hydrolysate

圖2 溫度對酶解液乳化活力指數(shù)的影響Fig.2 Influence of temperature on the EAI of the hydrolysate

2.3.2 溫度對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性的影響 溫度對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性的影響結(jié)果如圖2所示。在蛋白酶的最適溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，單位時(shí)間內(nèi)分子間的有效接觸次數(shù)增加，有利于蛋白的酶解。小麥蛋白酶解產(chǎn)物在35～40℃時(shí)EAI逐漸下降，而溫度在40℃左右時(shí)其乳化活力指數(shù)最低，而在溫度大于40℃后乳化活力指數(shù)呈上升趨勢，并且溫度55℃時(shí)乳化活力指數(shù)相對較大，并逐漸趨于平緩，由此可見，適當(dāng)?shù)脑黾臃磻?yīng)溫度，會(huì)使小麥蛋白的乳化能力提高，但是溫度過高會(huì)使小麥中蛋白質(zhì)變性，同時(shí)小麥淀粉開始糊化[13]，乳化能力反而下降，因此正交實(shí)驗(yàn)選取了45～55℃作為研究水平。

2.3.3 酶濃度對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性的影響酶濃度對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性的影響結(jié)果如圖3所示。小麥蛋白酶解產(chǎn)物在酶濃度為1%時(shí)乳化活力指數(shù)最大，當(dāng)在酶濃度增大至5%時(shí)，乳化活力指數(shù)逐漸減小，并趨于平緩。這可能是由于適當(dāng)?shù)拿笣舛仁剐←湹鞍追肿訑嗔殉奢^多親水性較強(qiáng)的小肽，分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，增加了蛋白質(zhì)的疏水部分，有利于膠束的形成，形成水包油結(jié)構(gòu)，促使乳化活性提高。但當(dāng)酶濃度太大時(shí)，其水解出的更短的小肽，極性更小，形成了油包水結(jié)構(gòu)，乳化活性反而降低[14]。因此正交實(shí)驗(yàn)選取了酶濃度1%～3%作為研究水平。

圖3 酶濃度（E/S）對酶解液乳化活力指數(shù)的影響Fig.3 Influence of enzyme concentration（E/S）on the EAI of the hydrolysate

2.4 胰酶水解小麥蛋白工藝優(yōu)化

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of orthogonal design

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性因素中有意義的水平做正交實(shí)驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳酶解工藝條件。按照表1的因素水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2數(shù)據(jù)極差分析可知，RC＞RB＞RA，各因素對乳化活性影響程度依次為：酶濃度＞溫度＞pH，酶濃度對小麥蛋白酶解產(chǎn)物乳化活性影響最為顯著，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到小麥蛋白酶解的最佳工藝條件為：A1B1C1，即pH7.5、溫度45℃、酶濃度E/S為1%，此時(shí)乳化活力指數(shù)為35.38m2/g。原始小麥蛋白粉的乳化活力指數(shù)僅為5.27m2/g，酶解產(chǎn)物的乳化活性有了明顯的提升，也顯著強(qiáng)于本課題組利用酸性蛋白酶對小麥蛋白粉進(jìn)行改性的最優(yōu)結(jié)果（17.69m2/g）[15]，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)所用的胰酶為復(fù)合酶，內(nèi)含胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，比使用單一酶類酶解產(chǎn)生更顯著的改性作用[16]。

最優(yōu)條件下水解度為4.73%，相對來說較低（表2）。很多研究都希望通過酶解改性小麥蛋白，以獲得較高的水解度，從而改善小麥蛋白的溶解性。但是從提升乳化活性角度來說，相對較低的水解度能夠獲得較高的乳化活性。這可能是由于水解度越大，水解出的肽段越小，包裹在油滴表面的保護(hù)層越薄，同時(shí)小麥蛋白鏈上的末端基團(tuán)數(shù)目增加，電荷增大到一定程度，吸附油滴的能力降低，最終導(dǎo)致乳化性能降低[17]。

2.5 小麥蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力

張玲[18]、崔鳳杰[19]、Wang等[20]報(bào)道了小麥蛋白酶解產(chǎn)物具有DPPH自由基清除能力，本實(shí)驗(yàn)（圖4）也證實(shí)了最佳工藝條件下（酶濃度為1%、溫度45℃、pH7.5）的小麥蛋白水解液具有一定的DPPH自由基清除能力，當(dāng)用量為200μL時(shí)，清除率為30.2%，但是顯著低于VC。清除率偏低可能由于酶解液中仍含有一定分子量的蛋白，而DPPH溶液由乙醇溶解，在測定過程中，蛋白會(huì)變性而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4 胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of the hydrolysate

2.6 小麥蛋白酶解產(chǎn)物金屬螯合能力

一些植物性原料，如黃花菜[21]、南瓜[22]提取物具備明顯的金屬螯合能力。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)小麥蛋白胰酶水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的螯合能力（圖5），用量為1000μL時(shí)，達(dá)到71.3%，顯著強(qiáng)于檸檬酸，但顯著低于EDTA。這可能是由于水解液含有未水解的蛋白質(zhì)與水解后的多肽，這些物質(zhì)能和鐵離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)；同時(shí)，也可能在酶解反應(yīng)時(shí)，由于淀粉酶的存在，生成了還原糖，還原糖與蛋白質(zhì)、酶解產(chǎn)生的多肽、氨基酸等發(fā)生了美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的呋喃類、吡嗪類、噻吩類、噻唑類等物質(zhì)[23]，這些物質(zhì)能夠絡(luò)合鐵離子。

圖5 胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物的金屬螯合能力Fig.5 Metal chelating activity of the hydrolysate

2.7 小麥蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布

采用GBT 22729-2008海洋魚低聚肽附錄A中的方法，測定最佳工藝條件下的小麥蛋白酶解液（水溶性部分）的分子量分布，分離圖譜如圖6所示，分子量分布表如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物的分子量主要分布在200～1000u，占65.99%，其次為1000～2000u，占12.34%，分子量較小，大部分是親水性較強(qiáng)的肽類，能夠適當(dāng)增加蛋白質(zhì)的水溶性，此時(shí)酶解產(chǎn)物中親水基團(tuán)和親油基團(tuán)形成了較為合適的比例，因而改善了小麥蛋白的乳化性能。同時(shí)分子量較小的肽容易穿過細(xì)胞膜從而更好地發(fā)揮生物活性，分子量小于3000u的肽類具有明顯的自由基清除能力[18]，因此這些肽類可能是酶解產(chǎn)物具備有乳化活性、抗氧化活性等功能特性的重要貢獻(xiàn)者。

圖6 胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物的分子量測定圖譜Fig.6 Chromatogram of molecular weight in the hydrolysate

表3 胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物的分子量分布Table 3 Distribution of molecular weight in the hydrolysate

2.8 小麥蛋白酶解產(chǎn)物氨基酸組成

取小麥蛋白酶解產(chǎn)物樣品，按設(shè)定條件進(jìn)行衍生和HPLC分離，小麥蛋白酶解產(chǎn)物中各種氨基酸的含量如表4。酶解產(chǎn)物經(jīng)完全水解后，獲得了15種氨基酸，總含量為3.76%（w/v），與張玲[17]的報(bào)道相似，其中谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量較多，谷氨酸含量達(dá)30.48%，其在蛋白質(zhì)中以谷胺酰胺形式存在，是一種條件必需基酸；同時(shí)，人體必需的氨基酸含量達(dá)7種。

表4 胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物的氨基酸組成Table 4 Content of amino acids in the hydrolysate

3 結(jié)論

本文以乳化活力為指標(biāo)，系統(tǒng)地研究了胰酶水解小麥蛋白的工藝條件，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性、分子量分布、氨基酸組成等功能特性。結(jié)果表明，最佳酶解條件為：酶濃度E/S為1%、溫度45℃、pH7.5，乳化活力指數(shù)達(dá)到35.38m2/g，此時(shí)水解度為4.73%，顯著提升了小麥蛋白的乳化活性。根據(jù)極差分析，三因素對乳化活力的影響大小為：酶濃度＞溫度＞pH。最佳工藝條件下的小麥蛋白酶解液具有一定的DPPH自由基清除能力，但顯著低于VC；首次發(fā)現(xiàn)了酶解液具有較強(qiáng)的金屬螯合能力，顯著強(qiáng)于課題組在類似條件下利用酸性酶、堿性酶、木瓜蛋白酶對小麥蛋白進(jìn)行改性的產(chǎn)物的金屬螯合能力。酶解小麥蛋白產(chǎn)物中多肽分子量主要分布在1000～200u，占65.99%；酶解產(chǎn)物中共檢測出了15種氨基酸，谷氨酸含量最高，達(dá)30.48%；肽類可能是酶解產(chǎn)物具備有乳化活性、抗氧化活性等功能特性的重要貢獻(xiàn)者。

綜上，胰酶水解小麥蛋白產(chǎn)物具有較大的食品添加劑、保健產(chǎn)品開發(fā)價(jià)值。但是值得注意的是，酶解產(chǎn)物中含有較多的苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸和酪氨酸四種具有較強(qiáng)苦味的氨基酸（15.25%），這些氨基酸大部分并不能被蛋白酶水解下來，而是存在于肽鏈中，形成分子量為500～1000u的多肽，這些多肽對酶解產(chǎn)物的風(fēng)味會(huì)造成嚴(yán)重的影響，這也是酶解產(chǎn)物有苦味、麥麩味的原因，因此必須進(jìn)一步研究酶解產(chǎn)物脫除異味的方法，以期為更好地應(yīng)用開發(fā)。

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