食品中尼泊金酯預處理技術及測定方法

周潔靜，鮑金勇，謝藍華，彭真福，楊公明

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州510640）

尼泊金酯又稱對羥基苯甲酸酯（Parabens），是國際上公認的三大廣譜高效食品防腐劑之一，是一類穩(wěn)定、低毒、高效的防腐劑，主要通過破壞微生物的細胞膜，使細胞內的蛋白質變性，抑制細胞的呼吸酶系和電子傳遞酶系的活性起防腐作用[1-3]。世界上許多國家和地區(qū)把尼泊金酯（鈉）作為食品防腐劑，如：美國、歐洲、日本、澳大利亞、加拿大、韓國、中國等。尼泊金酯已廣泛應用于焙烤食品[4]、啤酒[5]、乳制品[6]、水產品[7-9]、調味品[10-11]、肉制品[12]、腌制品[13]、飲料[14]、果蔬制品[15]以及果蔬保鮮[14]等多個領域。雖然尼泊金酯類作為國際上公認的廣譜高效食品防腐劑，并被多國應用，但近年研究發(fā)現(xiàn)，尼泊金酯具有類雌激素作用，可能對人體存在某些潛在危害[16-18]，引起社會對食品中尼泊金酯添加量及其檢測方法的關注。因此，本文綜述了直接稀釋法、有機溶劑法、超聲波輔助法、固相萃取法、固相微萃取法5種預處理技術和氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法3種測定方法在食品尼泊金酯檢測中的應用進展，探討其中存在的問題和進展。

1 食品中尼泊金酯的預處理技術

眾所周知，預處理是準確、快速檢測的關鍵步驟之一。其目的在于忠實原料基礎上有效富集樣品中分析物，并保持其生物活性與穩(wěn)定性，便于儀器的定性定量分析，以獲得準確、可靠的分析結果。目前，食品中尼泊金酯預處理技術主要有直接稀釋法、有機溶劑法、超聲波輔助法、固相萃取法、固相微萃取法。

1.1 直接稀釋法

直接稀釋法指利用水按一定的比例將樣品稀釋的方法[19]。該方法適用于液體態(tài)或者流體態(tài)的樣本。目前，檢測醬油、醋中尼泊金酯含量多采用直接稀釋法。

楊華梅[20]利用高效液相色譜法測定醬油中4種尼泊金酯含量時，稱取醬油樣品后，直接加水稀釋。結果表明，此法有很好的重現(xiàn)性。杜建中等[21]以醬油為實驗原料，采用膠束電動毛細管電泳法分離測定食品中尼泊金酯，在預處理過程中采用直接稀釋法并取得較好效果。

直接稀釋法對樣品進行預處理，具有操作簡單，有機溶劑用量少，節(jié)省時間、環(huán)保等優(yōu)點，但尼泊金酯不易溶于水，采用該方法進行預處理，會導致實驗結果偏低，且其僅適用于液體或流體態(tài)的樣品，使用范圍受限。

1.2 溶劑萃取法

溶劑萃取法指利用目標物在兩種互不相溶的溶劑中溶解度或分配系數的差異，使目標物從一種溶劑轉移到另一種溶劑中，將絕大部分目標物提取出來的方法。

近年來，溶劑萃取法在食品中尼泊金酯預處理的研究較多。Shurui Cao等[6]對奶制品、飲料、果醬和新鮮蔬菜中尼泊金酯進行檢測，分別用丙酮、乙醇、乙醚、甲醇和乙腈5種有機溶劑進行預處理。結果表明，乙醚和乙腈的回收率較高，乙腈更容易提取分析物，建議采用乙腈預處理后，進行檢測分析。GB/T 5009.31-2003《食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》[22]中利用乙醚提取醬油、醋、果汁和果醬中的尼泊金酯后采用氣相色譜檢測，分析結果準確可靠。Prichodko等[23]研究四氯化碳、氯化苯、溴化苯和苯乙烷4種預處理溶劑對尼泊金酯萃取效果的影響。結果表明，經四氯化碳溶劑處理后，萃取效率最低，氯化苯和溴化苯的萃取效率高于苯乙烷。

溶劑萃取法作為一種傳統(tǒng)的預處理技術，具有試劑易得、高效節(jié)能、操作簡便等優(yōu)點。尼泊金酯極易溶于有機溶劑，采用溶劑萃取法作為食品中尼泊金酯預處理方法，有效富集尼泊金酯，便于后續(xù)的檢測。但該方法處理時間長，消耗溶劑較多，而部分有機溶劑對人體產生毒害和造成環(huán)境的污染。

1.3 超聲波輔助法

超聲波輔助法是利用超聲波能強化萃取效率的預處理技術，其基本原理是超聲波在液體中振動，產生空化作用，液體內部形成真空，液體表面形成許多小氣泡，這種空化氣泡具有巨大的破壞作用，使樣品中的有效成分被提取液溶出，從而增加提取率[11]。

牛欣等[24]研究豆干中尼泊金酯檢測方法，將豆干置于超聲水浴中預處理，采用高效液相色譜測定。結果表明，該方法檢測尼泊金甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的檢出限分別為0.06、0.09、0.07、0.09μg/mL，能滿足實際檢測工作需要。龍朝陽等[25]研究食品中4種尼泊金酯的測定，采用超聲法處理樣品后進行檢測。結果表明，該方法分離度合理，操作簡單，穩(wěn)定性好。Yadollah Yamini等[14]對超聲輔助乳化、微萃取飲料中尼泊金酯進行研究，發(fā)現(xiàn)超聲預處理可提高尼泊金酯提取率，精密度和回收率均能滿足檢測需求。

此外，行業(yè)標準《蜂王漿中苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類檢驗方法》[26]采用超聲波預處理蜂王漿中尼泊金酯類。山東省地方標準《食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》[27]也采用超聲波輔助預處理食品中尼泊金酯，供液相色譜檢測。

國內外研究表明，超聲波預處理能提高尼泊金酯的得率，具有節(jié)省時間，溶劑用量少，反應條件溫和，避免高溫對提取成分的影響等優(yōu)點，已廣泛應用于各種樣品預處理。但超聲功率會影響尼泊金酯結構的穩(wěn)定性，這將直接關系到尼泊金酯檢測的準確性和精確性。所以對超聲預處理預處理技術中的工藝優(yōu)化是十分有必要的。

1.4 固相萃取法

1.4.1 固相柱萃取法 固相柱萃取是液固萃取和柱液相色譜技術相結合發(fā)展的一種樣品預處理技術，基本原理是基于樣品在兩相之間的分配差異，能有效從試樣中除去對分析干擾的物質，富集痕量組分，提高分析靈敏度[28]。

Cao S.R等[29]研究食品中尼泊金酯含量時，使用LC-C18固相萃取柱凈化預處理，聯(lián)合高效液相色譜檢測分析，最低檢出限為1.6～8.1μg/L，回收率為85.1%～95.4%。Lara Renz等[30]采用C18固相萃取柱對魚組織進行預處理后用高效液相質譜儀檢測。結果表明，58個樣品中尼泊金甲酯、乙酯、丙酯、丁酯含量均不超標，該方法最低檢測限為0.2ng/L。Li X.Q等[31]以可樂飲料、水果味碳酸飲料和果汁為原料，采用C18固相柱預處理。結果表明，所有樣品尼泊金酯添加量均在允許范圍內，回收率為88.7%～99.0%，是一種快速、準確、適合于飲料類的預處理技術。

與傳統(tǒng)液液萃取法相比，固相柱萃取具有回收率高，無需超純溶劑，有機溶劑消耗少，減少環(huán)境污染，能處理小體積樣品，無相分離操作，容易收集分析物，操作簡單，易于自動化的特點。但需要配備專門的萃取柱子，且柱子的填充物料、顆粒直徑等都會對萃取效果造成影響。因此，在實際應用過程中，應根據樣品形態(tài)、特性選擇相應萃取柱子，較好發(fā)揮固相柱萃取法的優(yōu)勢。

1.4.2 固相膜萃取法 固相膜萃取裝置由固相膜、溶劑過濾器和真空泵組成[32]。固相膜呈圓盤狀，由表面含有改良硅的多孔玻璃纖維基體組成。其萃取的基本原理與固相萃取柱相同。

嵇超[33]用C18固相膜提取飲料中尼泊金酯，將色素、甜味劑等干擾組分盡可能去除，考察pH對尼泊金酯萃取回收率的影響。結果發(fā)現(xiàn)溶液pH為4或5時，尼泊金酯萃取回收率較高，在91.8%～106.4%之間。該方法可同時檢測5種尼泊金酯，尼泊金甲酯、乙酯、異丙酯、丙酯和異丁酯的最低檢出限分別為0.05、0.04、0.04、0.04、0.04mg/L。

固相膜萃取設備簡單，不僅可最大限度除去干擾組分影響，還可顯著提高尼泊金酯得率。固相膜采用特殊材料制造而成，質地較軟，操作時動作要輕，否則容易造成膜片損壞。進行預處理時，需控制好樣品添加量和流速，添加量過大或者速度過快都容易損壞萃取膜。該方法預處理時間長，需要手工操作，難以擴大化使用。

1.5 固相微萃取法

固相微萃取是Pawliszyn[34]在1990年從固相萃取的基礎上發(fā)展起來的，是一種新的預處理方法，包括直接固相微萃取和頂空固相微萃取。直接固相微萃取是將纖維頭直接插入液體樣品中或暴露于氣體中，尤其適用氣態(tài)樣品和干凈基體液體樣品。頂空固相微萃取是將萃取頭置供試品上方蒸氣相中萃取、吸附組分，頂空取樣適于易揮發(fā)和半揮發(fā)物質[35]。利用固相微萃取食品中尼泊金酯，分析物直接被萃取、濃縮在萃取頭的固相上，可以快速、準確的得到分析結果。

Juan He等[36]采用一種新型固相微萃取纖維提取醬油中尼泊金酯和優(yōu)化提取條件。結果表明，當提取溫度為40℃，提取時間為25min，提取效果最好，此時回收率平均為92.17%～97.86%。Maryam Abbasghorbani等[37]通過合成一種固相微萃取氨丙基官能化的磁鐵礦納米顆粒提取水中尼泊金酯。該方法檢測的五種尼泊金酯平均回收率達95%。P.Canosa等[38]研究固相微萃取預處理水樣中尼泊金酯的工藝。結果表明，選用聚丙烯酸酯作為固相微萃取纖維，直接萃取水樣中尼泊金酯，結合使用氣相色譜質譜法進行檢測，可實現(xiàn)檢測限為0.001～0.025ng/mL，無基體效應，建議作定量檢測技術。

固相微萃取法無需有機溶劑、分析樣品量少、操作簡單、快速、費用低，但對實驗條件非常敏感[39]。影響固相微萃取效果因素包括萃取頭涂層選擇、取樣時間、萃取溫度、加鹽量和攪拌速度等，其中萃取溫度、萃取時間和加鹽量選擇是決定萃取效果的重要因素[40]，嚴格控制好預處理條件才能達到預期效果。

2 食品中尼泊金酯的測定技術

目前，尼泊金酯分析檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法、熒光分光光度法、薄層層析法等，其中應用最為普遍的是氣質聯(lián)用和液質聯(lián)用測定技術。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法指用氣體作為移動相的色譜法。其原理是將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入后，由于固定相對樣品中各組分吸附或溶解能力不同，即各組分在固定相和流動相之間的分配系數有差別，當組分在兩相中反復多次進行分配并隨移動相向前移動時，各組分沿管柱運動的速度就不同，從而達到分離的效果。該方法以其分離效率高、靈敏度高、分析速度快而廣泛應用于食品檢測領域。

Yi Han等[41]研究飲用水、碳酸飲料、綠茶飲料中尼泊金酯含量時，丙酮衍生化后采用氣相色譜-質譜法進行檢測。該方法對尼泊金甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的檢測限分別為2.9、1.3、0.59和0.46μg/L，回收率為73.6%～106.3%。Lin H.J等[42]采用氣相色譜法檢測醋、醬油、醬菜、魚露中尼泊金酯含量。結果表明，實驗中37個液體狀樣品過濾后直接進氣相色譜儀檢測，不僅簡單、快速，并且分析結果準確、可靠，可作為檢測液體狀食品中尼泊金酯的簡易方法。Saraji等[43]采用N，O-雙（三甲基硅基）乙酰胺作為衍生化試劑，結合氣相色譜-質譜法對水樣中5種尼泊金酯進行測定。結果表明，該方法的檢出限為0.001μg/L（尼泊金丁酯）到0.015μg/L（尼泊金甲酯）。

2.2 液相色譜法

液相色譜法，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。液相色譜法因其高效、高靈敏度而廣泛應用于食品檢測。

Yadollah Yamini等[14]利用液相色譜檢測食品中尼泊金甲酯和尼泊金乙酯，其檢測限分別為0.60、0.42μg/L，RSD（%）≤9.81。Shurui Cao等[6]以甲醇為流動相，采用LC-C18柱子檢測食品中尼泊金酯。該方法的最低檢測限為10μg/L，回收率為84.5%～108.8%。Hajimu lshiwata等[44]以乙腈-水為流動相，采用高效液相色譜測定蜂蜜中的尼泊金甲酯，檢測樣品中尼泊金甲酯平均濃度為（22.3±6.8）mg/kg，平均回收率為（86.0±1.9）%，最低檢出限為1mg/kg。

2.3 毛細管電泳

毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術，具有簡單、分離效率高、選擇性好，節(jié)約溶劑，選用多模式等優(yōu)點。但目前其在食品中尼泊金酯的檢測應用還處于初級研究階段。

Eva Blanco等[45]利用無水介質的毛細管電泳技術分離水樣中尼泊金甲酯、乙酯、丙酯和丁酯，聯(lián)合二極管陣列檢測器進行檢測，研究緩沖液的種類、pH、電解液的濃度、施加的電壓等因素對結果的影響。結果表明，甲醇作為緩沖溶劑可大大提高無水介質的毛細管電泳在線富集技術。杜建中等[21]以醬油為原料，采用膠束毛細管電泳法分離測定食品中尼泊金酯含量，研究緩沖溶液的濃度、表面活性劑濃度、電壓等條件對分離的影響。結果表明，在最佳條件下，食品中尼泊金酯各成分在10min內獲得基線分離，其濃度與峰面積之間具有良好的線性關系，平均回收率在97.2%～104%之間。

3 結論與展望

綜上所述，對于5種預處理技術，固相萃取法和固相微萃取法在操作簡便，節(jié)省時間方面具有明顯的優(yōu)勢，都具有選擇性高、富集痕量分析物、高靈敏度等特點。固相膜萃取法膜片容易損壞，固相柱萃取法使用的柱子就比較容易保管與操作。因此，建議選用固相柱萃取法作為食品中尼泊金酯的預處理方法。

雖然目前氣相色譜、高效液相色譜和毛細管電泳技術三種測定方法準確可靠、分離度佳、精密度好，都可作為測定尼泊金酯類的有效方法。但氣相色譜法要求對樣品進行衍生化處理，選擇合適的衍生試劑才可保證測定結果的可靠性和準確性。毛細管電泳技術分離效率雖高，節(jié)約溶劑，但每次分離測定進樣量少，制備能力差，不適合擴大化檢測。高效液相色譜法不僅避免氣相色譜法需要衍生化的缺點，還滿足自動化批量測定的要求，測定結果靈敏、準確、可靠。因此，建議選用高效液相色譜法測定食品中尼泊金酯的含量。

固相微萃取技術對實驗室條件非常敏感，但只要嚴格控制條件，該方法聯(lián)合高效液相色譜技術將是檢測食品中尼泊金酯含量的理想方法。該組合可大大縮短檢測時間，無需溶劑，降低檢測成本，分離度好，準確度和精密度高，是一種高效的檢測食品中尼泊金酯的方法。在實際檢測中，各種原料存在不同的差異，應根據具體原料的形態(tài)、特性等選擇合適的預處理方法與測定方法。

為了準確檢測食品中尼泊金酯類含量，檢測技術將會不斷改進和提高。另外，嚴格控制與監(jiān)管食品中尼泊金酯類的添加量，僅僅依靠檢測技術是不夠的。目前最重要的是食品生產企業(yè)應該嚴格遵守國家的法律法規(guī)，合理添加，杜絕違規(guī)超量添加。其實，從蜂蜜、香蕉等食品中提取的天然的尼泊金酯類安全性會比人工合成的尼泊金酯類可靠得多，成本也不算太高，大力開發(fā)應用，將是以后發(fā)展的主要方向。

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