醋蒸延胡索質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

林 源，魏雨辰，李曉東，卜其濤，許世輝，張成中（.溫嶺市中醫(yī)院，浙江 溫嶺 7500；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 004；.安徽省阜陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安徽 阜陽(yáng) 605）

延胡索為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥塊莖，主產(chǎn)地為浙江、安徽、江蘇等地，中醫(yī)藥應(yīng)用歷史悠久。其具有活血、行氣、止痛之功效，用于胸脅，脘腹疼痛，胸痹心痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，產(chǎn)后淤阻，跌撲腫痛[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)延胡索主要含有生物堿、有機(jī)酸、甾體、揮發(fā)油、糖類(lèi)、氨基酸等活性成分[2-3]，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、抗?jié)儭⒖咕?、抗炎、抗腫瘤、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量，抑制血小板聚集，抗心律失常，改善心肌供氧，增加心輸出量等藥理作用[4]。含延胡索的中藥處方及延胡索乙素制劑廣泛應(yīng)用于胃痛、傷痛、心絞痛、痛經(jīng)等多種痛癥。延胡索臨床應(yīng)用常以炮制品入藥，目前常用的炮制方法主要有炒制、醋制、酒制等[5]，其中又以醋制為主，醋制可以提高主要活性成分延胡索乙素的含量[6-7]，《中國(guó)藥典》（2015 年版）收載醋制延胡索為醋炙和醋煮，醋蒸法始載于明代盧之頤的《本草乘雅半偈》，但藥典及其他炮制規(guī)范等地方標(biāo)準(zhǔn)也無(wú)收載。本實(shí)驗(yàn)是在《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》（2019 年版）修訂課題的基礎(chǔ)上完成，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及操作過(guò)程，符合中藥標(biāo)準(zhǔn)制定規(guī)范要求。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超聲波清洗儀（德國(guó)Elma 公司）；分析天平（METTLER TOLEDO 公司）；多功能振蕩器（山東申儀電子科技有限公司）；高溫箱型電爐、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；普利菲爾超純水機(jī)（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）；賽默飛U3000系列液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試藥

本實(shí)驗(yàn)共收集10 批延胡索藥材，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥鑒定學(xué)教研室張成中老師鑒定為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖。延胡索乙素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110726-201516，純度：99.8%）；食用醋（江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司）；自制超純水；色譜級(jí)甲醇、氨水（國(guó)藥集團(tuán)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝

取凈制、切制后的延胡索，大小分檔，加醋拌勻、潤(rùn)透，置蒸制容器內(nèi)，用蒸汽加熱蒸透、內(nèi)無(wú)硬心，取出，干燥。炮制操作主藥與輔料按延胡索與米醋的質(zhì)量比為100∶20(kg/kg)制備醋蒸延胡索。

2.2 性狀鑒別

取10 批醋蒸延胡索分別編號(hào)為CYHS-01-01～10，觀察其大小、形狀、色澤、質(zhì)地、氣、味等總結(jié)其共性特征。本品呈不規(guī)則的圓形厚片，表面黃褐色，有不規(guī)則網(wǎng)狀皺紋。質(zhì)硬而脆，斷面黃褐色，角質(zhì)樣，有蠟樣光澤。微具醋香氣，味苦。

2.3 薄層鑒別

取醋蒸延胡索粉末1 g，參照《中國(guó)藥典》（一部）2015 年版延胡索薄層鑒別項(xiàng)下制備供試品溶液。另取延胡索對(duì)照藥材l g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取延胡索乙素對(duì)照品，加甲醇制成每l ml含0.5 mg 的溶液，制成對(duì)照品溶液。吸取上述3 種溶液各2～3μl 分別點(diǎn)于用1%氫氧化鈉溶液制備的同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮（9∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘缸中顯色約3 min后取出，待板上吸附的碘揮盡后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。從色譜圖上可以看出，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)（圖1）。

圖1 醋蒸延胡索薄層色譜圖

2.4 水分測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》（四部）2015 年版0832 水分測(cè)定法第二法共測(cè)定10 批次醋蒸延胡索飲片，水分最低值11.87%，最高值15.74%（表1），根據(jù)數(shù)據(jù)及公式注：是樣本的平均數(shù)；t是置信水平為99%的學(xué)生t檢測(cè)值(單尾)；s是樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n是樣本的批數(shù)；MU 是不確定度評(píng)估（MU=0.127 0×xˉ）]計(jì)算，限度應(yīng)為15.61%，參照《中國(guó)藥典》（一部）2015 年版延胡索項(xiàng)下，擬定水分限度不得超過(guò)15.0%。

表1 10 批醋蒸延胡索水分測(cè)定結(jié)果（%）

2.5 總灰分測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》（四部）2015 年版2 302 灰分測(cè)定法共測(cè)定10 批次醋制延胡索飲片，總灰分最低值2.77%，最高值3.80%（表2），根據(jù)數(shù)據(jù)參照《中國(guó)藥典》（一部）2015 年版延胡索項(xiàng)下，根據(jù)公式計(jì)算，限度應(yīng)為：3.53%，參考《中國(guó)藥典》（一部）2015 年版延胡索項(xiàng)下總灰分限度，擬定不得超過(guò)4.0%。

表2 10 批醋蒸延胡索總灰分測(cè)定結(jié)果（%）

2.6 浸出物測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》（四部）2015 年版2 201 醇溶性浸出物測(cè)定法熱浸法，用稀乙醇作溶劑，共測(cè)定10 批次醋延胡索浸出物，10 批醋延胡索的浸出物在11.68%～18.20%之間（表3）。以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析測(cè)試數(shù)據(jù),基于測(cè)試數(shù)據(jù),設(shè)定浸出物限度的公式如下（其中，是樣本的平均數(shù)；t是置信水平為99%的學(xué)生t檢測(cè)值（單尾）t0.01,9=2.821；s是樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n是樣本的批數(shù)；MU是不確定度評(píng)估MU=0.141 3×）。浸出物測(cè)定限度為：10.41%。擬定醇溶性浸出物測(cè)定法，參照《中國(guó)藥典》2015 年版（四部）2 201 測(cè)定，用稀乙醇作溶劑，浸出物不得少于11.0%。

表3 10 批醋蒸延胡索浸出物測(cè)定結(jié)果（%）

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH 至6.0）（55∶45）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 mn。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備

取P2O5減壓干燥12 h 后延胡索乙素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml 含46 μg 的溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備

取醋蒸延胡索粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1∶20）混合溶液50 ml，稱(chēng)定重量，浸漬1 h 后加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用濃氨試液-甲醇（1∶20）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 ml，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 ml 量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 測(cè)定法

分別精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液與醋蒸延胡索供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得（圖2、圖3）。

圖2 延胡索乙素對(duì)照品色譜圖

圖3 醋蒸延胡索樣品色譜圖

2.7.5 線性范圍考察

精密稱(chēng)取純度為99.8%的延胡索乙素對(duì)照品適量置50 ml 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，分別精密量取一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為0.010 1、0.020 2、0.040 4、0.080 9、0.121 3、0.161 8 mg/ml 的對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定含量，以濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=931.64X+5.140 5(r=0.999 95)。

2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取CYHS-01-010 樣品約0.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液制備方法處理，測(cè)定含量，平行取樣測(cè)定6 次，計(jì)算每次測(cè)定延胡索乙素的含量為0.097%，RSD 為2.4%，符合要求。

2.7.7 精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取延胡索乙素對(duì)照品溶液10 μl 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，平行測(cè)定8 次，計(jì)算RSD為1.1%，符合要求。

2.7.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取CYHS-01-010 樣品約0.5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液制備方法處理，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 測(cè)定含量，計(jì)算每次測(cè)定延胡索乙素的RSD為1.8%，符合規(guī)定。

2.7.9 加樣回收率試驗(yàn)

取CYHS-01-010 樣品約0.25 g，精密稱(chēng)定，精密加入含延胡素乙素0.202 2 mg 的對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法處理，得相關(guān)溶液，進(jìn)液相色譜儀處理，計(jì)算含量及加樣回收率，理論要求加樣回收率85%～110%（CYHS-01-010 含量為0.097%），RSD<5%（表4）。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7.10 樣品含量測(cè)定

測(cè)定10 批樣品，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算，結(jié)果參照《中國(guó)藥典》（一部）2015 年版延胡索項(xiàng)下制訂，擬定含量限度為：不得少于0.050%（10 批檢品含量差別不大，最大值與最小值差別接近1 倍），見(jiàn)表5。根據(jù)公式計(jì)算，限度應(yīng)不得少于0.060%，醋蒸為醋制延胡索的一個(gè)炮制規(guī)格，結(jié)合《中國(guó)藥典》（2015 年版）一部延胡索項(xiàng)下的含量限度，設(shè)定按干燥品計(jì)算，延胡索乙素（C21H25NO4）不少于0.050%。

表5 10 批醋蒸延胡索含量測(cè)定結(jié)果

2.8 標(biāo)準(zhǔn)其他項(xiàng)目

辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)。具有活血，行氣，止痛之功。性味與歸經(jīng)、功能與主治、用法與用量、儲(chǔ)藏等項(xiàng)目參照現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》（一部）2015 年版延胡索項(xiàng)下制定。

3 討論

蒸法炮制藥材早在2000 多年前的醫(yī)藥文獻(xiàn)《五十二病方》中就有“陳藿，蒸而取其汁”記載，漢代張仲景的《傷寒論》中有“烏梅...蒸之”，至明代繆希雍《炮炙大法》中已有近百味藥材的蒸制記載。蒸法的廣泛應(yīng)用使其成為中藥炮制最常用的炮制工藝之一。中藥延胡索的炮制在宋代出現(xiàn)了醋炒、醋煮、鹽炒等工藝，及至明清時(shí)又出現(xiàn)了醋紙煨、酒煮等工藝，延胡索醋蒸始載于明代《本草乘雅半偈》“醋潤(rùn)，蒸之，從巳至亥，俟冷取出，焙干，研細(xì)用”。現(xiàn)在主要炮制方法為醋炙、醋煮、酒炙、醋蒸等，醋蒸延胡索臨床上雖廣泛應(yīng)用，但尚缺法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

延胡索經(jīng)過(guò)醋炙后，飲片中延胡索乙素的含量較醋炙前變化較小，但醋炙后延胡索煎劑中延胡索乙素的含量變化較大，溶出會(huì)顯著增加，表明延胡索醋制后大量生物堿和醋酸反應(yīng)生成生物堿鹽，可提高煎出量，繼而提高延胡索止痛作用[8-9]。江國(guó)榮等將延胡索生品分別經(jīng)醋炙、醋煮、醋烘、酒炙后，測(cè)定生物堿的含量，發(fā)現(xiàn)延胡索經(jīng)不同炮制后生物堿含量均有所升高，說(shuō)明臨床上可以根據(jù)治療需要，對(duì)延胡索采用醋烘、醋炙、酒炙等炮制方法來(lái)提高有效成分的含量[10]。李春等采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化延胡索醋蒸炮制工藝，以延胡索粗粉為原料，加醋量30%，悶潤(rùn)2 h，蒸制2 h 后，延胡索乙素的含量明顯提高[11]。鄭軍獻(xiàn)等對(duì)新采集的延胡索進(jìn)行加工炮制，發(fā)現(xiàn)通過(guò)不同炮制方法制備延胡索藥材，水煮法、蒸制法、烘干法在外形、性狀基本一致，但延胡索乙素及成品折干率相差較大，蒸制延胡索乙素含量比水煮高出16.35%，成品折干率比煮法高出3.52%，說(shuō)明蒸制法優(yōu)于水煮法。蒸制時(shí)間10 min，延胡索乙素含量達(dá)到最高，當(dāng)蒸制時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，其含量反而降低[12]。龍全江等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)煮制加工的延胡索藥材樣品中3 種生物堿的含量總體低于蒸制加工所得的延胡索藥材，其結(jié)果為延胡索藥材蒸制炮制工藝的確定提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和研究依據(jù)[13]。

在現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究分析，醋蒸延胡索具備現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》一部收載的醋炙延胡索質(zhì)量要求，且延胡索乙素的含量明顯高于藥典中醋炙延胡索的要求，延胡索乙素可以作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，止痛、鎮(zhèn)靜，降低成癮性、保護(hù)大腦的作用；也可以作用于心血管系統(tǒng)，抗心律失常、改善血流動(dòng)力學(xué)、降低血脂[14]。延胡索乙素含量的增加符合醋制增強(qiáng)行氣、止痛之功的炮制目的。因此制定醋蒸延胡索質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求應(yīng)為：性狀為不規(guī)則的圓形厚片，表面黃褐色，有不規(guī)則網(wǎng)狀皺紋。質(zhì)硬而脆，斷面黃褐色，角質(zhì)樣，有蠟樣光澤，微具醋香氣，味苦；水分不超過(guò)15%；總灰分不超過(guò)5%；以稀乙醇作溶劑，浸出物不少于11.0%；延胡索乙素（C21H25NO4）含量，按干燥品計(jì)算不少于 0.050%。