對(duì)藥酸棗仁-合歡花對(duì)抑郁癥睡眠障礙模型大鼠行為學(xué)及海馬5-HT、5-HIAA含量的影響

鄧 巍，杜曉娜，施學(xué)麗，蔡 濤，薛麗飛，李建橡，郭超峰

（1.開封市第二中醫(yī)院，河南 開封 475000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

睡眠障礙是抑郁癥最早出現(xiàn)、最常見的癥狀之一，以入睡困難、多夢(mèng)、易醒及早醒為特征，可加重抑郁癥的病情，延緩其康復(fù)進(jìn)程。嚴(yán)重的抑郁癥睡眠障礙（sleep deprivation depresslon，SDD）會(huì)導(dǎo)致自殺［1］，因此，尋找有效治療SDD 的方法十分必要。筆者在總結(jié)歷代醫(yī)家治療抑郁癥、失眠經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)SDD 的發(fā)生、發(fā)展與心肝關(guān)系密切，認(rèn)為心肝功能失調(diào)是導(dǎo)致抑郁、引發(fā)失眠的重要因素，肝氣郁結(jié)、心神不安是SDD 的重要病機(jī)，疏肝解郁、寧心安神是治療SDD 的基本法則［2］，認(rèn)為郁寐同治，則寐安郁自解，郁解寐自安。

酸棗仁具有補(bǔ)肝寧心、斂汗生津的功效，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抗抑郁藥理活性［3-4］。合歡花有解郁安神、理氣和胃功效，研究證明其具有抗抑郁功效［5-6］。二者配伍能疏肝解郁，寧心安神，治療抑郁性失眠效果良好［2］。因此本實(shí)驗(yàn)以慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)加快速動(dòng)眼相（rapid eye movement，REM）睡眠剝奪所致SDD模型大鼠為觀察對(duì)象，研究對(duì)藥酸棗仁-合歡花對(duì)SDD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，同時(shí)檢測(cè)海馬5-羥色胺（5- hydroxytryptamine，5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）含量，并計(jì)算兩者的比值，初步探討對(duì)藥酸棗仁-合歡花抗抑郁的作用機(jī)理，為臨床治療SDD提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 雄性健康清潔級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。大鼠在室溫23～25 ℃、12 h 光照∕12 h 黑暗晝夜交替的環(huán)境下，自由飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 炒酸棗仁（批號(hào)170801921）、合歡花（批號(hào)20170101）購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)滕建北教授鑒定符合藥典要求，并委托廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室制成浸膏干粉，存在4 ℃冰箱內(nèi)備用。鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（批號(hào)31612026），為北京萬(wàn)生藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。5-HT 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（CSB-E08364r）為武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品；5-HIAA ELISA 檢測(cè)試劑盒（CSB-E13983r）為武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品。

2 方 法

2.1 分組及造模 大鼠適應(yīng)環(huán)境正常喂養(yǎng)1 周后，用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)［7］篩選，去除3 min 內(nèi)總分?jǐn)?shù)低于30 分或（和）高于120 分的大鼠。選出60 只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組15只。除正常組群養(yǎng)外，其它組孤養(yǎng)，并參照文獻(xiàn)［8］，進(jìn)行21 天的造模。從第19 天開始，采用小平臺(tái)水環(huán)境法［9］，對(duì)模型組、西藥組、中藥組大鼠進(jìn)行72 h 連續(xù)快速動(dòng)眼相（REM）睡眠剝奪，剝奪箱為玻璃水箱，長(zhǎng)30 cm× 寬30 cm× 高40 cm 的圓形水箱，水箱中心有直徑為6 cm 的圓形平臺(tái)，箱中注滿水，水面與平臺(tái)距離約1 cm。大鼠在平臺(tái)上可自由飲食，如果睡眠，會(huì)因肌張力松弛和節(jié)律性垂頭而掉入水中，從而達(dá)到剝奪REM 睡眠的目的，制備成慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)加REM 睡眠剝奪SDD 大鼠模型。在造模過(guò)程中西藥組、模型組大鼠各死亡1只，死亡原因不明。

2.2 給藥 造模當(dāng)天開始灌胃給藥，西藥組予鹽酸文拉法辛，劑量為0.008 g∕（kg·d），灌胃容積為10 ml∕kg；中藥組予對(duì)藥酸棗仁-合歡花，劑量為8 g∕（kg·d），灌胃容積為10 ml∕kg；正常組及模型組灌胃給予等容積生理鹽水（10 ml∕kg）。每日1次，連續(xù)21 d。

2.3 糖水消耗實(shí)驗(yàn) 適應(yīng)性喂養(yǎng)期即開始實(shí)驗(yàn)大鼠含糖飲水訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)需要4 天，第1 天每籠大鼠同時(shí)給2瓶1%的蔗糖溶液，第2天每籠大鼠同時(shí)放1瓶1%的蔗糖溶液和1 瓶純水，第3 天禁飲食，第4 天每籠大鼠同時(shí)放1 瓶1%蔗糖水和1 瓶純水，均先稱重。1 h 后，取回2 瓶水，再次稱重，計(jì)算各組大鼠的糖水偏愛值，糖水偏愛值= 糖水消耗量∕總液體消耗量（即糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 用大小通用Morris水迷宮法對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評(píng)估，水池直徑160 cm，高55 cm，水深30 cm，平臺(tái)直徑12 cm，高29 cm，沒于水下1 cm，使平臺(tái)不可見。池底黑色，水中加入墨汁，使其呈黑色不透明狀。水溫24±2 ℃。每天在固定時(shí)間測(cè)試，操作輕柔，避免不必要的應(yīng)激刺激，測(cè)試結(jié)束后都要及時(shí)用吹風(fēng)機(jī)吹干大鼠毛發(fā)，避免感冒，并且把水池清洗干凈。水池上方的槍式攝像機(jī)自動(dòng)記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡（黑水白物），最后將數(shù)據(jù)和指標(biāo)結(jié)果導(dǎo)入到Excel，經(jīng)SPSS軟件分析處理得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4.1 定位航行試驗(yàn) 從第17 天對(duì)受試大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，將受試大鼠分別從4個(gè)象限入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠在120 s 內(nèi)到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間，即為潛伏時(shí)間，大鼠到達(dá)平臺(tái)后，使其在平臺(tái)上停留20 s。如果在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留20 s，逃避潛伏期記錄為120 s。如果在平臺(tái)上的時(shí)間不到20 s，大鼠掉下或跳入水中繼續(xù)游泳，則將大鼠重新放回平臺(tái)上，并重新計(jì)時(shí)，使在平臺(tái)的時(shí)間到達(dá)20 s，以確保每只大鼠在每次實(shí)驗(yàn)后有相等的時(shí)間來(lái)觀察和獲取空間信息。連續(xù)訓(xùn)練3 天，于實(shí)驗(yàn)第20 天進(jìn)行正式定位航行試驗(yàn)，取大鼠120 s內(nèi)從4個(gè)象限入水點(diǎn)到達(dá)平臺(tái)所需的平均時(shí)間，作為該只大鼠的逃避潛伏期時(shí)間。

2.4.2 空間探索試驗(yàn) 第21天撤掉平臺(tái)，由原平臺(tái)所在對(duì)角象線入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

2.5 海馬5-HT、5-HIAA 含量的測(cè)定 造模第21 天，行為學(xué)測(cè)試后，將各組大鼠用10%水合氯酸麻醉，腹主動(dòng)脈取血后，斷頭處死大鼠，將大鼠頭部放置冰臺(tái)上，迅速分離出海馬，冷生理鹽水沖去血液，將海馬稱重，-80 ℃冰箱保存。ELISA 法檢測(cè)，操作方法依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差進(jìn)行分析，組間多重比較采用最小顯著差法（LSD）檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 見表1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 （±s）

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 （±s）

注：與正常組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P ＜0.05，④P ＜0.01

組 別正常組模型組西藥組中藥組n 15 14 14 15劑量（g∕kg）－ －0.008 8逃避潛伏期時(shí)間（s）31.8±2.53 54.2±2.15①44.5±2.36③42.3±3.84③穿越平臺(tái)次數(shù)（次）5.8±1.3 2.3±1.5②4.4±1.4④4.5±1.6④

由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間增多（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組、中藥組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短（P＜0.05），進(jìn)入平臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.01）。

3.2 各組大鼠糖水偏愛值的比較 見表2。

表2 各組大鼠糖水偏愛值的比較 （±s）

表2 各組大鼠糖水偏愛值的比較 （±s）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組西藥組中藥組n 15 14 14 15劑量（g∕kg）－ －0.008 8造模前79.3±2.11 76.4±2.14 77.9±3.20 79.1±2.37造模第21天77.5±2.16 48.6±2.18①68.7±3.22②69.3±2.64②

由表2可知，造模前，各組大鼠糖水偏愛值沒有明顯差異（P＞0.05）。造模第21 天，與正常組比較，模型組大鼠糖水偏愛值明顯降低（P＜0.05）；與模型組大鼠比較，中藥組、西藥組大鼠糖水偏愛值均明顯升高（P＜0.05）。

3.3 各組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量的比較 見表3。

表3 各組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量比較 （±s）

表3 各組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量比較 （±s）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組西藥組中藥組n 15 14 14 15劑量（g∕kg）－ －0.008 8 5-HT（ng∕ml）484.54±29.43 331.46±20.89①391.53±19.31②441.67±27.84②5-HIAA（ng ∕ml）15.56±0.64 11.56±0.91①12.93±0.80②12.14±0.77②5-HIAA∕5-HT 比值0.032±0.004 0.029±0.003①0.031±0.002②0.031±0.003②

由表3可知，與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬5-HT 及5-HIAA 含量減少（P＜0.05），5-HIAA ∕5-HT比值下降（P＜0.05）；與模型組大鼠比較，中藥組、西藥組大鼠海馬5-HT 及5-HIAA 含量增加（P＜0.05），5-HIAA ∕5-HT比值升高（P＜0.05）。

4 討 論

隨著社會(huì)的進(jìn)步和競(jìng)爭(zhēng)的日益激烈，SDD 的發(fā)生率越來(lái)越高，臨床工作者對(duì)SDD 的治療愈來(lái)愈重視。睡眠障礙（主要是失眠）是抑郁癥的核心癥狀之一，是抑郁癥發(fā)生、復(fù)發(fā)的前兆癥狀或重要危險(xiǎn)因素，其嚴(yán)重程度與抑郁癥嚴(yán)重程度一致，臨床上99%的抑郁癥患者伴有睡眠障礙［10］。因此睡眠障礙的有效防治對(duì)于預(yù)防抑郁癥、減輕病情、縮短病程及改善結(jié)局有非常重要的意義。中醫(yī)學(xué)因具有天人合一的整體觀念，擅長(zhǎng)身心整體調(diào)理，在防治抑郁癥、失眠方面卓顯特色和優(yōu)勢(shì)，因此加強(qiáng)對(duì)防治SDD 有效方藥作用機(jī)制的研究，將對(duì)抑郁癥的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

抑郁癥的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。應(yīng)激性生活事件是心境障礙的明顯促發(fā)因素［11］，本實(shí)驗(yàn)采用目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的CUMS 結(jié)合孤養(yǎng)加REM 睡眠剝奪方法建立SDD 大鼠模型，用糖水消耗實(shí)驗(yàn)評(píng)估造模前后大鼠對(duì)糖水偏愛的程度，驗(yàn)證模型是否復(fù)制成功及藥物干預(yù)是否有效。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠糖水偏愛值降低，說(shuō)明SDD 模型大鼠對(duì)獲得獎(jiǎng)賞的快感反應(yīng)下降，與SDD 患者的核心癥狀（快感缺失）非常相似，說(shuō)明SDD 大鼠模型復(fù)制成功。經(jīng)對(duì)藥酸棗仁-合歡花治療21 d 后，中藥組大鼠糖水偏愛值增加，說(shuō)明其具有治療SDD的功效。

臨床上SDD 患者常存在認(rèn)知方面的改變，如學(xué)習(xí)記憶障礙、思維緩慢、反應(yīng)遲鈍等。Morris 水迷宮是研究和評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的應(yīng)用最廣泛的行為實(shí)驗(yàn)［12］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與正常組大鼠比較，模型組大鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期時(shí)間增加（P＜0.05），在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)的次數(shù)減少（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組、中藥組逃避潛伏期時(shí)間縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)增多（P＜0.01）。提示對(duì)藥酸棗仁-合歡花可以提高SDD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，存在多種假說(shuō)，但單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)是至今研究最早也最深入的假說(shuō)?！皢伟芳僬f(shuō)”認(rèn)為抑郁癥發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)主要與腦內(nèi)單胺遞質(zhì)5-HT 和（或）NE 的缺乏密切相關(guān)。5-HT 是腦內(nèi)極為重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它不僅參與對(duì)焦慮、抑郁情緒的調(diào)節(jié)，還參與睡眠的生理調(diào)節(jié)過(guò)程［13］，被稱為是腦內(nèi)的“致眠因子”［14］。海馬5-HT 含量或功能異?？梢l(fā)精神病、睡眠障礙等疾病，并與學(xué)習(xí)、記憶、行為和情緒密切相關(guān)。5- HIAA 是5-HT 的代謝終產(chǎn)物，腦內(nèi)5-HIAA 和5-HT 的比值能間接反應(yīng)5-HT 的活躍程度［15-16］。本實(shí)驗(yàn)采取ELISA 測(cè)定大鼠海馬5-HT、5-HIAA 含量，并計(jì)算兩者之間的比值來(lái)探討對(duì)藥酸棗仁-合歡花治療SDD 的作用機(jī)制。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)21天的造模后，與正常組比較，模型組大鼠海馬5-HT、5-HIAA 含量及其比值均下降（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、中藥組5-HT、5-HIAA 含量及其比值均升高（P＜0.05）。

本研究證明，對(duì)藥酸棗仁-合歡花可減緩SDD 模型大鼠的抑郁行為，具有抗抑郁作用，并能提高其學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與提高海馬部位5-HIAA、5-HT 含量及其比值有關(guān)，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究，如檢測(cè)外周血液中5-HT、5-HIAA 含量，并分別與中樞5-HT、5-HIAA 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以確定對(duì)藥酸棗仁-合歡花能夠改善SDD 的癥狀是否與同時(shí)調(diào)控中樞與外周5-HT、5-HIAA含量有關(guān)。