超高液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用測定苦玄參的化學成分

陳 暉，丘 琴

（廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200）

苦玄參，又名蛇總管、魚膽草、落地小金錢、四環(huán)素草，為玄參科植物苦玄參Picria felterrae Lour.的干燥全草，分布于廣西、廣東、貴州和云南南部等地，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。臨床常用于風熱感冒、咽喉腫痛、喉痹、痄腮、脘腹疼痛、痢疾、跌打損傷、癤腫、毒蛇咬傷。電噴霧離子源質譜具有靈敏度高、操作簡便、分子離子峰豐度高等優(yōu)點，本實驗采用超高效液相色譜-高分辨質譜（UPLC-Triple TOF-MS）聯(lián)用技術初步分析苦玄參的化學成分，為苦玄參的臨床應用提供理論參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 色譜儀器為島津LC-30A 超高液相色譜系統(tǒng)：包括二元高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）；質譜儀器為AB Sciex Triple TOF 5600+，XEVO G2-S QTOF∕MS質譜系統(tǒng)和Masslynx 4.1質譜工作站；SQP電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；優(yōu)普Ulupure 實驗室超純水儀（上海優(yōu)普實業(yè)有限公司）。

1.2 試藥與試劑 實驗用苦玄參全草1批，2018年11月采自廣西梧州，經(jīng)廣西一心醫(yī)藥馬利飛副主任中藥師鑒定為玄參科植物苦玄參Picria felterrae Lour.的干燥全草。甲醇（默克股份兩合公司，批號：JB034007）；乙腈（色譜純，批號：JA034131）和甲酸（色譜純，批號：JC034117）均為默克股份兩合公司產(chǎn)品；95%乙醇（分析純，批號：170505）為西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；甲醇（分析純，批號：20170920）為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；水為純凈水。

2 方法和結果

2.1 供試品的制備 稱取苦玄參全草1 g，精密稱定，加入70%乙醇在90 ℃恒溫水浴中加熱回流1 h，過濾，濾液置于水浴鍋上蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至2 ml 的容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，將溶液轉移到離心管，高速離心10 min（13 000 r∕min），將上清液過0.22 μm微孔濾膜，備用。將樣品放入4 ℃冰箱保存，保存時間不超過24 h。

2.2 色譜條件 色譜柱為C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫40 ℃；流速為0.3 ml∕min；進樣量為2 μl；流動相采用乙腈（B）-0.2%甲酸（A）水溶液的梯度洗脫：0 min（5%B），0.1～37 min（5%～30%B），37.1～40 min（30%～5%B）。

2.3 質譜條件 離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓分別為5 500 V，離子源溫度為600 ℃，去簇電壓（DP）分別為100 V，碰撞能量（CE）分別為35 eV，碰撞能量擴展（CES）分別為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2 為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA 設置響應值超過100 cps 的6 個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。

離子化模式為電噴霧負離子模式，離子源電壓分別為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓（DP）為100 V，碰撞能量（CE）為-35 eV，碰撞能量擴展（CES）為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1 為60 PSI，輔助氣2 為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA 設置響應值超過100 cps 的6 個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。

3 結果與討論

3.1 苦玄參供試品溶液的總離子流圖 在ESI正離子模式下，苦玄參供試品溶液的總離子流圖見圖1；在ESI 負離子模式下，苦玄參供試品溶液的總離子流圖見圖2。

圖1 正離子模式下苦玄參提取物的總離子流圖

圖2 負離子模式下苦玄參提取物的總離子流圖

3.2 數(shù)據(jù)分析 采用高分辨質譜對數(shù)據(jù)庫中的活性成分匹配，定性分析苦玄參中藥活性成分?？嘈⒋继崛∫涸谡撾x子模式下共檢測到33種中藥活性成分，其中響應強度大于10 000的中藥活性成分共有19種，其中推測出10種成分。見表1。

表1 苦玄參的化學成分分析結果

化合物1：一級質譜圖中存在離子峰［M-H］-（m∕z 623.1981），理論計算值為623.1975（calcd for C29H35O15），高分辨質譜實測獲得的精確質量與理論計算值高度一致，得出此化合物的分子式為C29H36O15；其二級質譜中檢測到主要碎片離子峰（m∕z 461.1615），（m∕z 161.0000），推測（m∕z 461.1615）離子是化合物丟失一個162Da 的咖啡酰基產(chǎn)生的，m∕z161.0000 是咖啡酸負離子脫水的產(chǎn)物，因此推測化合物結構有咖啡?；?，結合文獻［1-2］，推測該化合物是阿克苷。

化合物2：在提取離子流圖中tR=9.89 min 處還有一個強度很大的離子峰，對應的一級質譜基峰為［M-H］-（m∕z 623.1981），其理論計算值為623.1975（calcd for C29H35O15），此化合物的二級質譜裂解的碎片離子與化合物1完全一致，顯示有咖啡?；男盘枺椿衔? 和化合物1 為同分異構體。據(jù)文獻報道，含有不飽和芳香酰基的順反異構體在混合溶液中會互相轉化而達到平衡［1］，故推測該化合物可能為一對順反異構體，結合文獻［1］，推測該化合物是異阿克苷。

化合物3：一級質譜中存在較強的離子峰［M-H］-（m∕z 487.1464），在負離子模式下，高分辨質譜實測獲得的精確質量與理論計算值高度一致，得出此化合物的分子式為C21H28O13，該化合物在二級質譜下裂解的主要碎片離子峰有（m∕z 179.0375），該碎片離子為咖啡酸脫去一個H+得到，（m∕z 161.0251）為咖啡酸脫去一份子水得到，（m∕z 135.0467）該碎片離子為咖啡酸脫去H-CO2所得，結合文獻［3-4］，推測該化合物為肉蓯蓉苷F。

化合物4：在提取離子流圖中tR=30.66 min峰對應的一級質譜基峰為m∕z 455.3539，在負離子模式下該化合物的［M-H］-離子理論值質荷比為（m∕z 455.3531），與實驗測量值僅相差0.00353 Da，根據(jù)元素組成和參考文獻，推測該化合物分子式為C30H48O3，該化合物在負離子模式下比較穩(wěn)定，沒有裂解的二級質譜，故推測該化合物為齊墩果酸［5］。根據(jù)文獻［3］可知齊墩果酸廣泛存在于玄參科多種植物中。

化合物5：該化合物是在正離子模式下裂解，化合物一級質譜圖存在正離子［M+H］+（m∕z 457.3671），因此計算出分子式為C30H48O3，根據(jù)文獻［5］，該化合物在正離子模式下不穩(wěn)定，極易發(fā)生裂解，主要碎片離子有m∕z 439.3576，m∕z 233.1897，m∕z 421.3468，m∕z 201.1633，m∕z 149.1329 等。其二級質譜中豐度較大的碎片離子（m∕z 439.3576），是由準分子離子（m∕z 457.3671）失去一分子水形成。結合文獻［6］，推測該化合物是熊果酸，是齊墩果酸的同分異構體，該化合物廣泛存在于玄參科多種植物中。

化合物6：該化合物在負離子模式下發(fā)生裂解，其一級質譜圖存在較強離子峰［M-H］-（m∕z 651.2297），其理論計算值為651.2288（calcd forC31H40O15），與實驗測量值僅相差0.0009 Da。二級質譜中檢測到的碎片離子峰（m∕z 475.1781）［M-H-Feruloyl］-為化合物脫掉阿魏酸所得，（m∕z 193.0520）［M-H-HMP］-，（m∕z 175.0418）［M-HHMP-H2O］-，這些碎片離子峰與文獻［10］報道一致，故推測該化合物是地黃苷，地黃苷廣泛存在于玄參科多種植物中［11］。

化合物7：該化合物在負離子模式下裂解，一級質譜中存在負離子［M-H］-（m∕z 761.4126），因此計算出分子式為C41H62O13，化合物的二級質譜中存在碎片離子（m∕z 675.3328）、（m∕z 615.3530）、（m∕z 529.2802），其中碎片離子（m∕z 615.3530）［M-146-H］-提示分子中存在一個鼠李糖，以上數(shù)據(jù)與文獻中報道苦玄苷A1 的MS 的數(shù)據(jù)一致［1］，故推測該化合物為苦玄苷A1?？嘈誂1 是苦玄參重要的有效成分［7］。

化合物8：該化合物在正離子模式下發(fā)生裂解，其一級質譜圖中存在較強離子峰［M+H］+（m∕z 271.0607），其理論值（m∕z 271.1348），高分辨質譜實測獲得的精確質量與理論計算值高度一致，因此得出此化合物的分子式為C15H10O5，其二級質譜中檢測到碎片離子（m∕z 243.0656）、（m∕z 153.0186）與文獻報道的數(shù)據(jù)一致［1］，故推測該化合物為芹菜素，據(jù)文獻報道，芹菜素是苦玄參中的主要成分之一，能在苦玄參的醇提液中檢測到該化合物［2，7］。

化合物9：該化合物在正離子模式下發(fā)生裂解，一級質譜中存在離子峰［M+H］+（m∕z 443.3879），其理論值（m∕z 443.3884），實驗測得值與理論值高度一致，故該化合物的分子式為C30H50O2，在二級質譜檢測到重要碎片離子（m∕z 425.3759）［M+H-H2O］+；（m∕z 203.1783）［M+H-C15H26OH2O］+與文獻［8］報道的相關數(shù)據(jù)一致，故推測該化合物為白樺脂醇。白樺脂醇是苦玄參種子的成分之一［9］。

化合物10：該化合物在正離子模式下發(fā)生裂解，其一級質譜中存在較強離子峰［M+H］+（m∕z 483.3103），計算出其分子式為C30H42O5，二級質譜中檢測到的碎片離子峰（m ∕z 325.2151）為［M+H-C8H11O2-H2O］+所 得，（m ∕z 307.2045）為［M+H-C8H11O2-H2O-CH3-H］+所得，（m∕z 189.1266）為［M+H-C17H26O4］+所得，上述碎片離子峰與文獻［12］報道一致，故推測該物質為苦玄參酮1。

4 小 結

本實驗采用液質聯(lián)用技術，對苦玄參的醇提物進行初步研究，發(fā)現(xiàn)提取物中含有三萜類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類和多種苯丙酸（如肉桂酸、咖啡酸等），以及葡萄糖、鼠李糖等縮合成苷化合物，因而同系物較多。通過主要離子峰和碎片離子峰信息，推測出其中10種化合物。

本實驗鑒定的化合物大多數(shù)源于對已知化合物的篩查，對未知化合物進行結構確認仍較為困難，尤其是同分異構體及同系物，需要結合C譜、H譜等技術進一步分析，以獲得化合物的準確結構。本實驗可為苦玄參的化學成分研究提供依據(jù)，也可為苦玄參的臨床應用提供參考。