氣腫疽NanA基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

馬玉騰， 羅永仁， 姜永越， 于成東， 張 皓， 金 鑫*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.琿春邊境經(jīng)濟(jì)合作區(qū)綜合服務(wù)站，吉林 琿春 133315；3.圖們市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧管理總站，吉林 圖們 133000；4.敦化市民政局，吉林 敦化 133700)

氣腫疽(Clostridium chauvoei) 是一種主要侵襲于反芻動物的急熱性、敗血性傳染病，形狀為呈梭狀或湯勺狀的革蘭氏染色陽性桿菌[1]，動物感染后主要表現(xiàn)為暴發(fā)性肌壞死，通常會在短時(shí)間內(nèi)死亡，由于死亡率極高，為畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了重大損失[2-3]。其致病因子為氣腫疽梭菌，在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，發(fā)病迅速，死亡率高[4-5]。該病的傳染源主要是病畜，傳遞途徑是土壤。當(dāng)動物采食或口鼻接觸土壤時(shí)，芽孢能夠通過呼吸道或消化道進(jìn)入組織，同時(shí)體內(nèi)的厭氧條件能夠促進(jìn)芽孢萌發(fā)、繁殖和外毒素的產(chǎn)生[6-7]。動物采食被這種土壤污染的飼料和飲水，經(jīng)口腔和咽喉創(chuàng)傷侵入組織，也可由松弛或微傷的胃腸粘膜侵入血流而感染全身[8]。一直以來，該病被認(rèn)為只感染反芻動物，但2007年以來卻出現(xiàn)了該病引發(fā)人氣性壞疽和結(jié)腸炎而死亡的2例報(bào)告[9]，在過去10年中該病迅速成為全球?qū)W者的研究熱點(diǎn)。

疫苗的使用是疾病免疫的重要手段，而氣腫疽缺乏經(jīng)濟(jì)有效的治療方法，因此氣腫疽疫苗的研發(fā)就尤為重要。傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)量小，保護(hù)性差，因此核酸疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗等疫苗的研發(fā)和推廣具有廣闊的前景[10-11]。在氣腫疽梭菌眾多毒力因子中，氣腫疽梭菌NanA基因具有重要研究價(jià)值。本試驗(yàn)構(gòu)建了氣腫疽NanA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，以探索真核表達(dá)質(zhì)粒作為核酸疫苗的可能性，為氣腫疽核酸疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及試劑

pMD18-T Simple Vector購于TaKaRa寶生物工程有限公司，pVAX1載體由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?，鼠抗氣腫疽梭菌NanA蛋白由延邊大學(xué)預(yù)防實(shí)驗(yàn)室制備；延邊株氣腫疽梭菌由延邊地區(qū)病牛病料采集，分離鑒定并純化后于延邊大學(xué)動物醫(yī)學(xué)系預(yù)防實(shí)驗(yàn)室保存[12]；限制性內(nèi)切酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，均購自O(shè)MEGA有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)級分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上氣腫疽梭菌JF4135菌株NanA基因序列(GenBank號：FM213082.1)，通過Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了1對特異性引物用于氣腫疽梭菌真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。上游引物添加BamHI 酶切位點(diǎn)及Kozak序列(GCCACCATGGAA)，下游引物添加XhoI酶切位點(diǎn)及終止密碼子，該引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3 延邊株氣腫疽梭菌DNA的提取與NanA基因的擴(kuò)增

使用酚—氯仿抽提法提取延邊株氣腫疽梭菌DNA并分別以F1、F2為引物擴(kuò)增NanA基因。

PCR反應(yīng)體系：延邊株氣腫疽梭菌DNA 2.0 μL、dNTP2.0 μL、10×ExTaqBuffer2.5 μL、F1/F2 1.0 μL、ExTaq0.25 μL、dd H2O 16.25 μL，總體系為25 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s、61 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 氣腫疽梭菌NanA基因的克隆與鑒定

將經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的片段NanA基因與pMD18-T Simple Vector混合，4 ℃過夜進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物加入到Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒pMD 18-T-NanA，以重組質(zhì)粒pMD 18-T-NanA為模板，利用上述引物進(jìn)行鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒pVAX1-NanA的構(gòu)建及鑒定

將pMD 18-T-NanA和pVAX1菌種分別接種于Amp+抗性和Kan+抗性的液體LB中，37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)12～16 h。對pMD 18-T-NanA及pVAX1質(zhì)粒進(jìn)行提取，將提取質(zhì)粒用BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。將上述純化回收得到的NanA目的基因片段與真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1片段連接轉(zhuǎn)化至Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒pVAX1-NanA并進(jìn)行鑒定。將PCR和雙酶切鑒定均為陽性的重組pMD 18-T-NanA質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 NanA基因的擴(kuò)增

以F1、F2為引物，純化的氣腫疽梭菌DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到NanA目的基因片段，大小為1 950 bp，與預(yù)期大小相同(圖1)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：水對照；2：NanA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pMD 18-T-NanA的PCR及雙酶切鑒定

以F1、F2為引物， pMD 18-T-NanA質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增得到1 950 bp大小的目的片段，PCR鑒定結(jié)果見圖2。

M：DL 5 000 DNA Marker；1～2：pMD 18-T-NanA PCR鑒定產(chǎn)物

將PCR初步鑒定為陽性的pMD 18-T-NanA質(zhì)粒，用BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定[13-14]，得到了大小分別為2 692 bp和1 950 bp的2條目的片段，表明獲得了大小相符的重組質(zhì)粒pMD 18-T-NanA，雙酶切的鑒定結(jié)果見圖3。

M: DL 5 000 DNA Marker；1～4：pMD 18-T-NanA雙酶切鑒定產(chǎn)物

2.3 重組質(zhì)粒pVAX1-NanA的PCR及雙酶切鑒定

以F1、F2為引物，以pVAX1-NanA質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增得到1 950 bp大小的目的片段，PCR鑒定結(jié)果見圖4。

M：DL2 000 DNA Marker；1：pVAX1-NanA PCR鑒定產(chǎn)物

將PCR初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pVAX1-NanA，用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到了分別為2 999 bp和1 950 bp大小的2條目的片段，雙酶切的鑒定結(jié)果見圖5。

M：DL5 000 DNA Marker；1-5：pVAX1-NanA質(zhì)粒雙酶切鑒定產(chǎn)物

2.4 NanA基因核苷酸同源性比對

同源性比對分析結(jié)果表明：氣腫疽梭菌延邊株NanA基因與NCBI公布的JF4135(GenBank登錄號FM213082.1)菌株序列相比共有3處點(diǎn)核苷酸突變，分別于NanA基因第198位由T突變?yōu)镃、第778位由A突變?yōu)镚、第1261位由A突變?yōu)镚。比對顯示核苷酸序列的同源性均為99.8%(圖6)。

3 討論與結(jié)論

氣腫疽在全球范圍內(nèi)流行，在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家分布較廣泛，動物感染后主要表現(xiàn)為暴發(fā)性肌壞死，通常會在短時(shí)間內(nèi)死亡，由于死亡率極高，使得該病成為畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因[14-15]。氣腫疽梭菌病原體一般通過芽胞狀態(tài)侵入肌體, 在具有一定腐敗物的無氧腸腺內(nèi)進(jìn)行出芽繁殖, 可經(jīng)淋巴與血液循環(huán)進(jìn)行散播, 并在肌肉與肝組織內(nèi)長期潛伏, 肌體肌肉群受傷或出現(xiàn)變化后, 就為病原體的繁育提供較合適的條件[16]。我國最早的氣腫疽疫苗以帶有病原體的組織液為材料制作活性疫苗，但活性疫苗可能無法提供對抗該病的最佳免疫反應(yīng)即細(xì)胞免疫，目前國內(nèi)使用最廣泛的是氣腫疽滅活疫苗，但很多臨床報(bào)告和報(bào)道指出該病的發(fā)生仍然普遍存在[17]。

氣腫疽其主要毒力基因?yàn)榧?xì)胞毒素CctA、唾液酸酶NanA和透明質(zhì)酸酶NagI、透明質(zhì)酸酶NagH等。唾液酸酶又稱為神經(jīng)氨酸酶，能夠水解寡糖、糖醛酸苷、糖蛋白和糖脂中的末端唾液酸殘基和甘氨酸殘基，從而影響細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)并能夠破壞宿主免疫調(diào)節(jié)的通路[18]。由于其通過裂解唾液酸而在發(fā)病過程中起重要的作用，被認(rèn)定為一種重要的毒力因子[19-20]。神經(jīng)氨酸酶由氣腫疽梭菌NanA基因編碼，基因序列全長為2 519 bp，其分子質(zhì)量為81 kDa，編碼772個氨基酸，其主要功能區(qū)在第193～771個氨基酸之間。中央的高變區(qū)對于神經(jīng)氨酸酶的真核疫苗構(gòu)建是至關(guān)重要的，因此該試驗(yàn)擴(kuò)增的部分選取了該段的1 950 bp片段。將克隆后測序得到的氣腫疽梭菌NanA基因核苷酸序列與NCBI中發(fā)布的JF4135菌株(GenBank登錄號：FM213082.1)序列進(jìn)行同源性比對，并發(fā)現(xiàn)了3處點(diǎn)突變。分別于NanA基因第198位由T突變?yōu)镃、第778位由A突變?yōu)镚、第1261位由A突變?yōu)镚。其核苷酸序列的同源性均為99.8%。該試驗(yàn)采用pVAX1作為真核表達(dá)載體，該載體在腫瘤疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染性疾病等的防治方面皆有應(yīng)用。段雪巖、張永佳以pVAX1為載體，分別構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-CctA和pVAX1-FliA并在Vero細(xì)胞中表達(dá)[21-22]，結(jié)合該研究結(jié)果，綜合分析真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-CctA和pVAX1-FliA的免疫效果，未來可進(jìn)一步進(jìn)行氣腫疽梭菌其他基因真核表達(dá)的探究。由于CctA基因能夠參與溶血和細(xì)胞毒性作用，F(xiàn)liA基因能夠促進(jìn)細(xì)菌移動從而促進(jìn)感染過程，NagI能夠影響細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)和組織的正常生理機(jī)制，破壞肌肉周圍疏松結(jié)締組織，NanA基因能夠影響細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)并破壞宿主免疫調(diào)節(jié)的通路。針對不同毒力基因的特性與作用，利用多種基因共同誘導(dǎo)個體免疫有較好的研究前景，目前國內(nèi)已有針對于多種傳染病的多價(jià)苗，能夠使個體得到完全的免疫保護(hù)作用。

該試驗(yàn)以氣腫疽NanA基因?yàn)榛A(chǔ)，構(gòu)建了pVAX1-NanA真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行了鑒定。為氣腫疽梭菌NanA基因的進(jìn)一步探究提供了依據(jù)，為氣腫疽核酸疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6 NanA基因核苷酸同源性比對