白細(xì)胞介素-35在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用

潘治平，崔焌輝，沈鋒

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德醫(yī)院肛腸外科，浙江 杭州 310012）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）是炎癥性腸病的一種亞型，其特征在于腸道的慢性炎癥。近幾十年來，UC的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)有所增加，特別是在發(fā)展中國(guó)家[1]。由2個(gè)亞基Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)基因3（epstein-barr virus induced gene 3, EBI3）和白細(xì)胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）p35亞基的異二聚化組成的白細(xì)胞介素-35（Interleukin-35, IL-35）具有通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Tregs）和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells, Bregs）介導(dǎo)的免疫抑制作用，使其成為治療UC的候選者[2]。本文深入討論IL-35的表達(dá)和生物學(xué)功能，并為將來的臨床試驗(yàn)和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 IL-35的組成

IL-12家族由IL-12、白細(xì)胞介素-23（Interleukin-23, IL-23）、白細(xì)胞介素 -27（Interleukin-27, IL-27）和IL-35組成，屬于造血細(xì)胞因子的I型家族（見表1）。與大多數(shù)具有單體、同源二聚體或同源三聚體功能的細(xì)胞因子不同，IL-12細(xì)胞因子是少數(shù)幾種具有異構(gòu)體功能的細(xì)胞因子之一[3]。IL-12相關(guān)細(xì)胞因子是由α鏈（p19、p28或p35）和β鏈（p40或Ebi3）組成的異二聚體蛋白質(zhì)。α鏈具有4個(gè)α螺旋束結(jié)構(gòu)，典型的細(xì)胞因子有IL-6、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子，而β鏈與可溶性細(xì)胞因子受體鏈具有同源性。因此，IL-12是p35（IL-12α）/p40（IL-12β）異二聚體，IL-23是p19（IL-23α）/p40（IL-12β）異二聚體，IL-27是p28（IL-27α）/EBI3異二聚體。IL-35是由p35α亞基和EBI3β亞基組成的異源二聚體。Ebi3僅含有3個(gè)蛋氨酸和4個(gè)半胱氨酸殘基，而IL-12 p35含有10個(gè)蛋氨酸和7個(gè)半胱氨酸殘基，據(jù)推測(cè)兩者之間不存在二硫鍵[4]。IL-12家族細(xì)胞因子的受體也共享亞基。IL-35受體由IL-12Rβ2/gp130異二聚體或同源二聚體組成。IL-12Rβ2是IL-12受體的組成部分，而gp130是多種細(xì)胞因子受體的組成部分，包括IL-6、IL-11、IL-30、腫瘤抑制因子M和白細(xì)胞抑制因子[5]。

表1 IL-12細(xì)胞因子家族的結(jié)構(gòu)和特征

2 IL-35的表達(dá)和分泌

EBI3與IL-12的p35亞基結(jié)合形成EBI3/p35異二聚體IL-35，EBI3與p35的體內(nèi)關(guān)聯(lián)最初在人胎盤提取物中得到證實(shí)。p35基因在許多類型的細(xì)胞中以低水平組成型表達(dá)，因此幾乎無所不在[6]。IL-35由小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs組成型表達(dá)[7]。BARDEL等[8]發(fā)現(xiàn)在非刺激的人體胸腺、脾、淋巴結(jié)、扁桃體、腸和血液Treg細(xì)胞中未檢測(cè)到IL-35。有研究還發(fā)現(xiàn)IL-35在IL-35誘導(dǎo)的CD4+Treg細(xì)胞群中表達(dá)，定義為iTr35[9]。除了CD4+Tregs之外，IL-35還被證明在前列腺癌患者的CD8+Treg細(xì)胞群中表達(dá)，并介導(dǎo)抗原特異性抑制[10]。IL-35的表達(dá)在體內(nèi)和體外都能有效地調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答。

與其他成員不同，IL-35不是由抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞，其主要由CD4+Foxp3+Tregs分泌[7]。Tregs對(duì)IL-35的最大表達(dá)和分泌需要與效應(yīng)性T細(xì)胞（effective T cell, Teff）接觸，這增強(qiáng)了Tregs的抑制能力[11]。此外，在較小程度上活化的B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞也是IL-35的來源[12]。IL-35對(duì)干擾素-γ有分泌作用，可作為Toll樣受體3和4的激動(dòng)劑。IL-35還可誘導(dǎo)常規(guī)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+Foxp3-分泌iTr35，這種正反饋級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)極大地抑制了多種效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用。LI等[13]發(fā)現(xiàn)只有在脂多糖或炎癥細(xì)胞因子的熱原擾動(dòng)下，才能在單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到IL-35 mRNA的存在，揭示了IL-35只在炎癥刺激反應(yīng)中分泌。

3 IL-35的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

IL-35不符合大多數(shù)細(xì)胞因子特有的典型高親和力及低親和力受體復(fù)合物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式[14]。IL-35的信號(hào)通路似乎與IL-12、IL-27的信號(hào)通路重疊。這可以通過其與IL-12Rβ2的同二聚體（即IL-12Rβ2∶IL-12Rβ2和gp130∶gp130）或異二聚體，以及分別由IL-12R和IL-27受體（即gp130∶IL-12Rβ2和IL-12Rβ2∶wsx-1）組成的gp130的非優(yōu)先結(jié)合來證明信號(hào)的部署[15]。gp130受體是包括IL-6、IL-11和IL-27在內(nèi)的多種細(xì)胞因子受體的組成部分。另一方面，IL-12Rβ2是一種嚴(yán)格意義上的IL-12細(xì)胞因子家族受體[16]。IL-35與包含gp130和/或IL-12Rβ2的同二聚體或異二聚體結(jié)合后開始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。受體結(jié)合后，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子進(jìn)行。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 1（signal transducers and transcriptional activators 1,STAT1）的磷酸化在IL-35與gp130受體結(jié)合后發(fā)生，而STAT4的磷酸化在IL-35與IL-12Rβ2結(jié)合后發(fā)生。將IL-35與缺乏STAT1或STAT4的T細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)其抑制能力顯著降低，因此，STAT1和STAT4的協(xié)同作用對(duì)于IL-35介導(dǎo)的抑制至關(guān)重要。

COLLISON等[15]結(jié)果表明，與全功能IL-12Rβ2/gp130異二聚體受體復(fù)合物的信號(hào)傳導(dǎo)相比，通過同源二聚體受體對(duì)傳遞的信號(hào)是由STAT1和STAT4調(diào)節(jié)的，從而導(dǎo)致IL-35抑制活性的部分喪失。通過同二聚體受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在抑制Teff細(xì)胞增殖的同時(shí)不能誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為iTr35，原因是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中只有1支（包括同源二聚體）是開啟的。相反，WU等[17]報(bào)道由IL-12Rβ2∶gp130組成的同源二聚體受體對(duì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)既能介導(dǎo)iTr35的誘導(dǎo)，又能介導(dǎo)Teff的抑制。有證據(jù)表明，IL-12Rβ2能被B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)，影響IL-35在免疫系統(tǒng)中的生物活性[18]。SHEN等[2]的研究說明IL-35在B細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過IL-12Rβ2∶wsx-1組成的異二聚體受體復(fù)合體來調(diào)節(jié)的。

4 IL-35的免疫抑制作用

IL-35活性相關(guān)的主要抑制機(jī)制是抑制T細(xì)胞增殖和效應(yīng)功能。有關(guān)IL-35活性的基礎(chǔ)研究利用白細(xì)胞介素-12 p35亞基-/-和Ebi3-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)缺乏IL-35表達(dá)的CD4+Tregs抑制T細(xì)胞增殖的能力顯著降低，這一發(fā)現(xiàn)在許多模型中被重復(fù)[9，18-19]。重組 IL-35（recombinant IL-35, rIL-35） 抑 制 T細(xì) 胞反應(yīng)的能力也在研究中得到了清楚的說明，其可以降低T細(xì)胞增殖和T細(xì)胞因子的表達(dá)這些研究由于難以生成活性的IL-35異二聚體形式而變得有些復(fù)雜[20]。IL-35的抑制活性不僅限于CD4+Tregs，因?yàn)镃D8+CTLA-4+Tregs也以非接觸IL-35依賴的方式抑制自體T細(xì)胞的增殖[10]。

雖然對(duì)IL-35機(jī)制的研究集中在抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖的能力上，但是IL-35也在抑制輔助性T細(xì)胞17（helper T cell 17, Th17）反應(yīng)中發(fā)揮作用。表達(dá)IL-35的Tregs可抑制CD4+T細(xì)胞向Th17效應(yīng)細(xì)胞的分化，而缺乏EBI3的小鼠IL-17的產(chǎn)生明顯增加[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，rIL-35降低了Th17的分化及Th17細(xì)胞的功能[22]。除了其對(duì)Th17免疫的影響外，一份報(bào)告甚至提出rIL-35可以導(dǎo)致抗體滴度降低[20]。雖然體外研究已經(jīng)清楚地表明IL-35能夠直接作用于效應(yīng)T細(xì)胞，但I(xiàn)L-35抑制抗體反應(yīng)的能力可能表明IL-35也能夠作用于其他細(xì)胞群，也可能有助于體液免疫的輔助性T細(xì)胞應(yīng)答的抑制[22]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)體外免疫也被rIL-35抑制，其誘導(dǎo)人B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IL-35和IL-10的Bregs[2]。

最近，LI等[23]首次提出IL-35及其IL-12細(xì)胞因子家族成員是具有抗炎功能的穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子模式和具有促炎功能的危險(xiǎn)相關(guān)分子模式。IL-35不是特異性地與一種受體結(jié)合，而是松散地具有一種模式特征，被不同的IL-12家族受體雜亂地識(shí)別，這些家族受體為穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子模式受體。IL-35作為穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子模式結(jié)合同二聚體和異二聚體受體的潛在優(yōu)勢(shì)可能包括以下幾個(gè)方面：①IL-35在不同的炎癥過程中，無論哪種受體在不同的細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用，均可抑制廣泛的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)；②IL-35阻斷和干擾IL-6、IL-12和IL-27受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；③IL-35以高度敏感和有效的方式維持全身和組織穩(wěn)態(tài)。

5 IL-35與潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)性

UC以大腸黏膜和黏膜下層的潰瘍和炎癥為特征，被認(rèn)為與過度侵襲性T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腸道微生物群的免疫反應(yīng)有關(guān)，由環(huán)境觸發(fā)因素引起和重新激活[24]。目前，UC的藥物治療包括糖皮質(zhì)激素，免疫抑制劑和新興的生物療法（抗TNF-α單克隆抗體）。然而，仍有一大批患有難治性或復(fù)發(fā)性疾病的患者無法忍受目前可用的藥物治療。對(duì)UC患者腸道中免疫炎癥通路的分析表明，組織損傷是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞之間復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的相互作用所驅(qū)動(dòng)，其中細(xì)胞因子是這種相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)[25]。白細(xì)胞介素是相關(guān)細(xì)胞因子譜的關(guān)鍵成分，因此被確定為潛在的未來治療靶點(diǎn)。

LI等[26]首次證明活動(dòng)性的UC患者血清IL-35水平顯著低于健康對(duì)照組，與UC活動(dòng)性成反比。TAKAHASHI等[27]報(bào)道Tregs頻率在UC活動(dòng)期降低，與疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果表明Tregs的缺乏與潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)展有關(guān)，Tregs是IL-35的主要來源，因此可導(dǎo)致外周血中IL-35的減少。在結(jié)腸黏膜中，IL-35的過度表達(dá)和分泌增強(qiáng)可能在UC的炎癥過程中起一定作用。與正常結(jié)腸相比，Treg細(xì)胞在結(jié)腸炎區(qū)域的固有層中高度浸潤(rùn)。通過浸潤(rùn)免疫細(xì)胞遞送的IL-35增加，以對(duì)抗UC中的黏膜炎癥。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，根據(jù)表型可分為M1（經(jīng)典激活）和M2（替代激活）2種極化類型。M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞抑制炎癥、維持腸道免疫平衡。與正常人相比，UC患者的結(jié)腸組織表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)。隨著病情的發(fā)展，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)率也逐漸升高。WANG等[28]研究表明，IL-35重組蛋白可以顯著減少大腸組織中巨噬細(xì)胞的數(shù)量。盧戰(zhàn)軍等[29]研究發(fā)現(xiàn)IL-35可能通過調(diào)控SHIP1的表達(dá)，抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，緩解腸道炎癥。此外，免疫熒光染色顯示，IL-35重組蛋白能明顯抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。Tregs組成性地存在于腸黏膜中，通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖來抑制免疫反應(yīng)。有研究證實(shí)IL-35可以誘導(dǎo)Tregs的產(chǎn)生，Tregs的比例在IL-35重組蛋白處理后顯著上調(diào)[30]。

腸道炎癥主要由Th1、Th2和Th17細(xì)胞的免疫反應(yīng)介導(dǎo)。這些細(xì)胞與炎癥黏膜中的其他細(xì)胞之間的相互作用由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)，包括促炎和抗炎細(xì)胞因子。IL-10能拮抗Th1細(xì)胞因子，穩(wěn)定腸黏膜免疫平衡，是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)UC的發(fā)生起到保護(hù)作用[31]。近期研究表明IL-10在IL-35重組蛋白處理后上調(diào)；相比之下，血清和結(jié)直腸組織中的幾種促炎細(xì)胞因子，包括IL-6、IL-17和TNF-α均下降[31]。盡管炎癥細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，但I(xiàn)L-35在Th17細(xì)胞與Tregs的平衡中起著重要作用。一方面，IL-35能夠誘導(dǎo)iTr35細(xì)胞產(chǎn)生，更多的iTr35細(xì)胞進(jìn)一步分泌更多的IL-35。另一方面，IL-35通過Tregs的擴(kuò)張和IL-10的分泌有效地抑制Th1和Th17細(xì)胞。此外，IL-10在抑制巨噬細(xì)胞時(shí)可進(jìn)一步降低IL-6水平?？傊琁L-35可通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的分泌來誘導(dǎo)抗炎環(huán)境的產(chǎn)生。

針對(duì)腫瘤壞死因子的藥物已被認(rèn)為是緩解嚴(yán)重UC的首選藥物[32]，然而，也提高了不良事件的風(fēng)險(xiǎn)，如感染、狼瘡樣自身免疫反應(yīng)和超敏反應(yīng)。因此，需要一種靶向結(jié)腸的新型給藥方法，副作用較少，局部藥物濃度較高。最近ZHANG等[33]首次構(gòu)建了表達(dá)IL-35的靶向改造大腸桿菌（大腸桿菌/IL-35），并研究口服大腸桿菌/IL-35對(duì)小鼠模型中實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療效果，結(jié)果顯示IL-35治療組的疾病活動(dòng)指數(shù)顯著降低，中性粒細(xì)胞和CD3+細(xì)胞在結(jié)腸內(nèi)浸潤(rùn)更少；此外，大腸桿菌/IL-35治療組小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞減少，CD4+CD25+Foxp3+Tregs升高，結(jié)腸和血清IL-10、IL-35水平升高，IL-6水平降低。該研究表明，大腸桿菌/IL-35作為一種新型口服IL-35遞送系統(tǒng)減輕了結(jié)腸組織的炎癥損傷[33]。

UC與Treg/Th17的失衡密切相關(guān)，Tregs上調(diào)和/或Th17抑制可以對(duì)UC提供積極干預(yù)。IL-35在體外促進(jìn)Tregs的抑制功能和在體內(nèi)控制內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的增殖中起重要作用，同時(shí)IL-35能抑制Th17的分化和功能。因此，增加IL-35的表達(dá)可用于控制UC中黏膜炎癥的范圍，為UC的治療提供新的靶點(diǎn)。而利用靶向改造大腸桿菌編碼免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的基因治療方法，可能提供了一種潛在的途徑[33]。IL-35水平可高度指示UC中Treg穩(wěn)定性的程度。血清IL-35水平降低可能是體內(nèi)抗炎活性不足的表現(xiàn)，有望成為監(jiān)測(cè)UC疾病活動(dòng)的生物標(biāo)志物[26]。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)12年來IL-35的作用仍然知之甚少。IL-35是一種免疫抑制細(xì)胞因子，是自身免疫和傳染病期間免疫力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。IL-35主要通過減少巨噬細(xì)胞、CD4+T和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及提高Tregs的比例來減緩結(jié)腸炎的發(fā)病。此外，IL-35可以通過調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)因子來達(dá)到抑制炎癥的作用。IL-35可能是臨床上重要的診斷指標(biāo)，然而，作為潰瘍性結(jié)腸炎的合適治療策略，需要進(jìn)一步研究IL-35在UC免疫和炎癥調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的確切作用。