綠豆藥材質(zhì)量控制方法研究

安巧　石錦霞　周美　蔣坤　李星　夏文　吳貴輝

摘要 ? ?為了建立綠豆藥材的地方標(biāo)準(zhǔn)，采用經(jīng)驗、顯微鑒別法對該藥材性狀、顯微特征進(jìn)行描述;按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則相關(guān)方法，對綠豆中水分、灰分和酸不溶性灰分進(jìn)行了測定;采用薄層色譜法，以牡荊苷為對照，對藥材進(jìn)行定性鑒別;采用HPLC法，以牡荊苷為對照，采用Agilent ZOR-BAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）色譜柱，甲醇-水（40∶60）為流動相，檢測波長340 nm下進(jìn)行定量分析，建立綠豆中牡荊苷的含量測定方法。結(jié)果表明，該藥材性狀、顯微鑒別、薄層鑒別方法具有較強(qiáng)的專屬性，水分為9.91%～12.57%，總灰分為2.51%～3.22%，酸不溶性灰分為0.03%～0.11%，牡荊苷含量為0.127%～0.248%。上述結(jié)果表明，建立的標(biāo)準(zhǔn)具有很好的專屬性和準(zhǔn)確性，可以作為綠豆藥材的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞 ? ?綠豆;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);牡荊苷;薄層色譜法;高效液相色譜法

中圖分類號 ? ?R284.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）19-0047-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Research ?on ?Quality ?Standards ?of ?Mung ?Bean

AN Qiao 1，2 ? ?SHI Jin-xia 3 ? ?ZHOU Mei 2 ? ?JIANG Kun 1 ? ?LI Xing 1 ? ?XIA Wen 1 ? ?WU Gui-hui 1 *

（1 Guizhou Bailing Enterprise Group Pharmaceutical Co. Ltd.，Anshun Guizhou 561000; 2 The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences; 3 Guizhou University of Traditional Chinese Medicine）

Abstract ? ?In order to establish the local quality standards of mung bean，the morphological characters and microscopic characteristics of mung bean were described by means of empirical and microscopic identification. The contents of water，total ash and acid-insoluble ash were analyzed according to the methods of Chinese Pharmacopoeia（2015）.Vitexin was used to identify materia medica of mung bean by TLC. HPLC method was used to establish a quantitative method for the determination of vitexin contents in mung bean by using Agilent ZOR-BAX SB-C18（5 mm，4.6 mm×250.0 mm）chromatographic column and methanol-water（40∶60）as mobile phase with detection wavelength of 340 nm.The results showed that the morphological characters，microscopic features and TLC methods were proper，the congtents of water were 9.91%-12.57%，total ash were 2.51%-3.22%，acid-insoluble ash were 0.03%-0.11%，vitexin were 0.127%-0.248%. All of the above data proved that the established quality of coutrol method is specific and accurate，which is suitable for the quality evaluation of mung bean.

Key words ? ?mung bean;quality standard;vitexin;TLC;HPLC

綠豆，為豆科植物綠豆（Phaseolus radiatus L.）的干燥成熟種子，在中國各地均有種植，是常用的藥食兩用植物，具有降脂、抗腫瘤、減輕化療藥物毒性、解毒等功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，綠豆具有抗氧化[2-3]、抑菌[4-6]、抗腫瘤[7-9]、降血脂[10]、解毒[11]、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[12]等藥理作用。綠豆是《中國藥典》2015年版中收藏的多個成方制劑如護(hù)肝片、護(hù)肝丸、護(hù)肝顆粒、護(hù)肝膠囊、消絡(luò)痛片、消絡(luò)痛膠囊和清寧丸等的重要組成藥味。目前，綠豆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有《綠豆》（GB/T 10462—2008）（按糧油標(biāo)準(zhǔn)起草）;各省地標(biāo)收載的目錄有《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）、《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2008年版）、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2002年版）、《黑龍江省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2001年版）、《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2011年版）等。以上標(biāo)準(zhǔn)中并未對其藥效成分進(jìn)行定性、定量分析檢測，目前有文獻(xiàn)[13-16]報道了綠豆中牡荊苷和異牡荊苷的含量測定方法，但有的色譜峰分離不理想，有的流動相中添加酸，有的用乙腈做流動相。本研究用甲醇-水做流動相，色譜峰分離較好，且甲醇價廉易得，檢測經(jīng)濟(jì)成本低。本研究增加了綠豆質(zhì)量控制項，進(jìn)一步提升本品入藥安全可控性。本文的質(zhì)量控制方法可以作為綠豆的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更有利于制藥企業(yè)使用并鑒定藥材。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?儀器與材料

顯微鏡（舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司，XD20-RFL），Smar V350圖像采集系統(tǒng);CAMAG TLC VISUALIZER;KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;十萬分之一電子分析天平（Mettler Toledo Excellence Plus）;800離心機(jī)（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）;Agilent1200高效液相色譜儀。

牡荊苷對照樣品（批號111687-200602，中國食品藥品檢定研究院），甲醇為色譜純，娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純;GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）;10批綠豆藥材，均為市售。

1.2 ? ?性狀觀察

觀察綠豆樣品的性狀特征。

1.3 ? ?顯微特征鑒別

原藥材粉碎，過5號篩，取適量粉末，加水和氯醛液2～3滴，用細(xì)玻璃棒攪勻，并在酒精燈上加熱至透化，再滴加稀甘油1滴混勻，加蓋玻片即可。然后進(jìn)行顯微觀察。

1.4 ? ?薄層鑒別

1.4.1 ? ?溶液制備。精密稱取牡荊苷對照樣品1.07 mg，加70%甲醇制成濃度為0.535 mg/mL的溶液，作為對照樣品溶液。取綠豆粉末（過2號篩）2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇20 mL，超聲處理1 h，放冷，離心10 min（4 000 r/min），放冷;取10 mL于蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加70%甲醇2 mL使其溶解，離心10 min（4 000 r/min），過濾（微孔濾膜），取續(xù)濾液作為供試液。

1.4.2 ? ?樣品鑒別。照薄層色譜法（《中國藥典》（2015年版）第四部通則0502）試驗，分別吸取牡荊苷對照樣品溶液和上述供試樣品溶液各1 μL，點于同一GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，飽和20 min，展開，取出，自然晾干。

1.5 ? ?水分、總灰分及酸不溶性灰分檢測

按照中藥及其雜質(zhì)檢測與一般質(zhì)量控制方法，進(jìn)行水分、總灰分和酸不溶性成分檢測。

1.5.1 ? ?水分。取各產(chǎn)地綠豆粉末約3 g（過2號篩），精密稱定，按照《中國藥典》（2015年版）通則0832水分測定法第一法進(jìn)行測定。每批平行測定2份。

1.5.2 ? ?總灰分。取各產(chǎn)地綠豆粉末約5 g（過2號篩），精密稱定，按照《中國藥典》（2015年版）四部通則2302灰分測定法進(jìn)行測定。每批平行測定2份。

1.5.3 ? ?酸不溶性灰分。取灰分測定項所得的灰分，根據(jù)《中國藥典》（2015年版）四部通則2302進(jìn)行測定，每批平行測定2份，計算供試樣品中酸不溶性灰分的含量（%）。

1.6 ? ?HPLC法測定牡荊苷含量

1.6.1 ? ?方法確定。①檢測波長的選擇。采用Agilent1200型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器全波長掃描。②流動相的選擇。分別選擇乙腈∶水（23∶77）和甲醇∶水（40∶60）作為流動相，比較峰形和分離度。③提取條件的考察。取綠豆細(xì)粉（過3號篩）0.5 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入相應(yīng)的溶劑25 mL，精密稱定重量，選擇回流或超聲提取90 min，靜置，放冷，再稱定質(zhì)量，用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液離心（2 000 r/min，20 min），過濾，取續(xù)濾液作為供試樣品溶液;以牡荊苷作為考察指標(biāo)，考察回流和超聲提取方法的效果（平行做2份）。

1.6.2 ? ?含量測定。①色譜條件。采用Agilent ZOR-BAX SB-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）色譜柱;以甲醇-水（40∶60）為流動相;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;檢測波長為340 nm。②溶液制備。取牡荊苷對照樣品5 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照樣品儲備液;然后精密量取5 mL稀釋至10 mL，作為對照樣品溶液。取綠豆細(xì)粉（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流90 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液離心（2 000 r/min，20 min），過濾，取續(xù)濾液作為供試樣品溶液。③含量測定。取供試樣品溶液，依法測定，每批平行2份，計算牡荊苷的含量。

1.6.3 ? ?方法檢驗。一是系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。精密吸取對照樣品溶液、供試樣品溶液及空白溶劑各20 μL，注入高效液相色譜儀。二是線性關(guān)系考察。精密稱取牡荊苷對照樣品適量，用70%甲醇制成濃度為0.102 4 mg/mL的對照樣品儲備液，作為1號對照樣品溶液，精密量取1號對照品儲備液5 mL置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，作為2號對照樣品溶液。依次采取對半稀釋的方法得到3～5號對照樣品溶液。分別取1～5號對照樣品溶液（濃度依次為0.102 4、0.051 2、0.026 0、0.012 8、0.006 4 mg/mL）各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對照樣品濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。三是儀器精密度試驗。取1.6.2中對照樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，檢測儀器的精密度。四是方法精密度試驗。取綠豆細(xì)粉（過50目篩）約0.5 g，精密稱定，按1.6.2方法制備供試樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測方法精密度。五是重復(fù)性試驗。取同一批藥材6份，按1.6.2方法制備供試樣品溶液，進(jìn)樣分析。六是穩(wěn)定性試驗。取同一供試樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定峰面積。七是加樣回收率試驗。精密稱取已知含量的同一批藥材6份，各0.25 g，精密稱定，對照樣品的加入量按照1∶1加入，按1.6.2方法制備供試樣品溶液，依法測定。八是耐用性試驗。取各產(chǎn)地綠豆細(xì)粉各0.5 g，每批平行2份，精密稱定，按1.6.2方法制備供試樣品溶液，分別考察本方法在流動相比例、柱溫、流速的小范圍波動及不同廠家色譜柱下的測定結(jié)果。九是中間精密度試驗。在同一實驗室，在不同日期由不同分析人員在不同儀器上進(jìn)行測定，按1.6.2方法制備供試樣品溶液，依法測定。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?性狀

供試綠豆樣品呈類圓柱形或類球形，長4～6 mm、直徑3～4 mm，表面黃綠色、黃褐色或墨綠色，具光澤;種臍位于一側(cè)，呈白色縱向線形，長約為種子的1/3;種皮薄而韌，剝離后露出淡黃綠色或黃綠色的種仁;子葉2枚，肥厚;質(zhì)堅硬，難破碎;氣微，味淡，嚼之有豆腥味。

2.2 ? ?顯微特征

供試綠豆樣品粉末呈灰白色或淺黃白色。淀粉粒甚多，多為單粒，腎形、長橢圓形、類圓形、類三角形或不規(guī)則形。種皮柵狀細(xì)胞表面觀類多角形，壁較厚，胞腔細(xì)小或不明顯;側(cè)面觀細(xì)胞1列呈柵欄狀，狹長，胞腔條狀。種皮支持細(xì)胞1列，表面觀呈長圓形。星狀細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，由多數(shù)短分支狀突起，胞腔內(nèi)含黃棕色物。色素塊較多，黃棕色或綠黃棕色，存在于星狀細(xì)胞或薄壁細(xì)胞中（圖1）。

2.3 ? ?薄層鑒別

供試樣品色譜圖中，在與對照樣品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點（圖2）。說明上述條件能夠較好地將各斑點分離，顯色清晰。

2.4 ? ?水分、總灰分及酸不溶性灰分檢測

水分、總灰分及酸不溶性灰分檢測結(jié)果見表1。

2.5 ? ?HPLC法測定牡荊苷含量

2.5.1 ? ?方法確定。試驗結(jié)果表明，牡荊苷在340 nm有最大吸收;選擇乙腈∶水（23∶77）作為流動相峰形差、分離度差，而選擇甲醇∶水（40∶60）作為流動相峰形良好、分離度好;50%、70%甲醇回流提取時，牡荊苷含量較高，但50%甲醇提取沉淀物較多（表2）。因此，選擇340 nm作為檢測波長、甲醇∶水（40∶60）作為流動相、70%甲醇回流90 min作為提取方法。

2.5.2 ? ?含量檢測及方法檢驗。10份綠豆樣品中牡荊苷含量見表1。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果顯示，牡荊苷與其他色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按牡荊苷峰計不低于3 000，空白溶劑無干擾。對綠豆中牡荊苷含量進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為Y=32 238.213 5X-8.528 532 2（r=1.000），在0.006 4～0.102 4 mg/mL范圍內(nèi)牡荊苷含量的線性關(guān)系良好。儀器精密度試驗結(jié)果表明，牡荊苷峰面積RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。方法精密度試驗結(jié)果表明，牡荊苷峰面積的RSD為0.29%，表明方法精密度良好。重復(fù)性試驗中，牡荊苷的平均含量為0.145%，RSD為1.17%，表明重復(fù)性良好，符合分析方法的要求。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，供試樣品中牡荊苷含量的RSD為1.18%，表明供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率試驗中，牡荊苷的平均回收率為102.2%，RSD為1.17%，表明回收率良好，符合分析方法的要求。耐用性試驗分別考察本方法在流動相比例、柱溫、流速的小范圍波動及不同廠家色譜柱下的測定，結(jié)果表明，該方法耐用性較好（表3）。中間精密度試驗結(jié)果表明，該方法中間精密度良好（表3）。

3 ? ?結(jié)論與討論

為了建立綠豆藥材的地方標(biāo)準(zhǔn)，采用經(jīng)驗、顯微鑒別法對該藥材性狀、顯微特征進(jìn)行描述;按照《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部通則相關(guān)方法，對綠豆中水分、灰分和酸不溶性灰分進(jìn)行了測定;采用薄層色譜法，以牡荊苷為對照，對藥材進(jìn)行定性鑒別;采用HPLC法，以牡荊苷為對照，采用Agilent ZOR-BAX SB-C18 5 μm，4.6 mm×250.0 mm色譜柱，甲醇-水（40∶60）為流動相，檢測波長340 nm下進(jìn)行定量分析，建立綠豆中牡荊苷的含量測定方法。結(jié)果表明，該藥材性狀、顯微鑒別、薄層鑒別方法具有較強(qiáng)的專屬性，水分為9.91%～12.57%，總灰分為2.51%～3.22%，酸不溶性灰分為0.03%～0.11%，牡荊苷含量為0.127%～0.248%。

本研究建立了測定牡荊苷含量的HPLC法，該方法系統(tǒng)適應(yīng)性、儀器精密度、方法精密度、重復(fù)性、回收率、耐用性、中間精密度均較好，在0.006 4～0.102 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合分析方法的要求;且本方法用甲醇-水作流動相，色譜峰分離較好、甲醇價廉易得，檢測經(jīng)濟(jì)成本低。本研究收集了10個產(chǎn)地的綠豆藥材，具有一定的代表性，建議綠豆的水分≤15.0%，總灰分≤4.0%，酸不溶性灰分≤0.13%;以干燥樣品計算，牡荊苷含量≥0.10%。本研究增加了綠豆質(zhì)量控制項，進(jìn)一步提升綠豆入藥安全可控性。本文的質(zhì)量控制方法可以作為綠豆的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更有利于制藥企業(yè)使用并鑒定藥材。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 南京中醫(yī)藥大學(xué). 中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006：3176-3178.

[2] 鄒基豪，劉振春，李俠.綠豆中ACE抑制肽的分離純化及抗氧化研究[J].食品工業(yè)，2018，39（1）：168-172.

[3] 鐘葵，曾志紅，林偉靜，等.綠豆多糖制備及抗氧化特性研究[J].中國糧油學(xué)報，2013，28（2）：93-98.

[4] 李健，王旭，劉寧.綠豆提取物的抑菌作用研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，26（6）：680-683.

[5] 郭彩珍，褚盼盼，喬元彪.綠豆生物堿的提取及抑菌作用的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：987-990.

[6] 李梅青，孔祥淋，王康，等.明綠豆活性蛋白的分離純化及抗菌性鑒定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（7）：1084-1087.

[7] 黃銳，羅深恒，趙昌彩，等.重組綠豆BBI（6-33）結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析[J].天津科技大學(xué)學(xué)報，2016，31（1）：40-45.

[8] 唐煦，周國林.綠豆苯丙氨酸解氨酶的性質(zhì)及抗腫瘤作用研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，1996，24（1）：35-39.

[9] 陳漢源，鐘啟平.綠豆對實驗小鼠腫瘤誘發(fā)的預(yù)防作用[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1989，9（3）：231-234.

[10] 王沛，宋啟印，周吉吉，等.綠豆對動物的降血脂作用[J].沈陽藥學(xué)院學(xué)報，1990，7（1）：42-44.

[11] 王亞芳，李福元，圖門巴雅爾.綠豆的解毒作用及其機(jī)理研究進(jìn)展[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2014（6）：6-7.

[12] 周晨慧，張雪，徐道華.牡荊苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（4）：405-408.

[13] YAO Y，CHENG X Z.Contents of D-chiro-inositol，vitexin，and iso-vitexin in various varieties of mung bean and its products[J].Agric Sci China，2011，10（11）：1710-1715.

[14] 閆沖，劉紅霞.UPLC法測定綠豆中牡荊苷與異牡荊苷含[J].廣州化工，2012，40（10）：114-115.

[15] 萬婭瓊，程江華，吳翔.HPLC法檢測明綠萌動過程中牡荊素和異牡荊素含量變化規(guī)律[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（25）：105-106.

[16] 李艷榮，鄒萍萍，姜勇，等.綠豆藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國中藥雜志，2014，39（1）：94-99.