急性氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)解毒代謝途徑的研究

楊洋 孟繁星 王日昕

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315832）

在現(xiàn)階段大規(guī)模集約化養(yǎng)殖過(guò)程中，粗放投喂方式導(dǎo)致的餌料殘?jiān)?、飼料配比不均衡、飼喂密度大等因素使得養(yǎng)殖水體中氨氮含量超標(biāo)［1］。氨氮在水體中的存在形式分為兩種：離子態(tài)（NH4+）和非離子態(tài)（NH3），由于非離子氨是半徑較小的親脂性分子，極易擴(kuò)散進(jìn)入魚(yú)體，導(dǎo)致血氨濃度升高、紅細(xì)胞載氧能力下降，離子平衡紊亂，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到干擾等不良影響，因此相較于NH4+，NH3對(duì)魚(yú)體的毒害作用更大，常使魚(yú)體表現(xiàn)出呼吸困難、反應(yīng)遲緩、抽搐甚至衰竭而死亡［2］。已有大量研究表明氨氮對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性，如氨氮刺激下，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重的組織病理學(xué)病變，氧攝取功能?chē)?yán)重受損［3］；質(zhì)子化的NH4+通過(guò)取代K+，干擾Na+/K+-ATPase（NKA）和Na+：K+：2Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NKCC）的正常運(yùn)作而阻礙離子調(diào)節(jié)［4］；通過(guò)抑制丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶而干擾三羧酸循環(huán)，進(jìn)而影響?hù)~(yú)體能量代謝［5-6］等。因此，對(duì)于氨氮脅迫對(duì)魚(yú)體的損害機(jī)制和魚(yú)體對(duì)氨氮環(huán)境的耐受機(jī)制的研究顯得尤為重要。

目前，已有研究對(duì)常見(jiàn)淡水魚(yú)［7］和現(xiàn)存氣呼吸型海水魚(yú)的氨氮耐受機(jī)制進(jìn)行了研究，其機(jī)制主要包括：（1）降低蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝；（2）降低環(huán)境pH；（3）NH4+連續(xù)排泄 ；（4）NH3持續(xù)排泄；（5）合成無(wú)毒的谷氨酰胺；（6）合成尿素等［8-9］。其中降低蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝的策略對(duì)于大彈涂魚(yú)并不適用，這是由于彈涂魚(yú)在陸生環(huán)境中需要利用蛋白質(zhì)和氨基酸分解釋放的能量來(lái)維持其跳躍和爬行等生命活動(dòng)［10-11］；同樣，大彈涂魚(yú)也不采用合成尿素的方式排泄氨，相關(guān)研究指出，尿素生成能力存在于軟骨魚(yú)類(lèi)和大多數(shù)陸生脊椎動(dòng)物中［12］，在硬骨魚(yú)中幾乎檢測(cè)不到鳥(niǎo)氨酸尿素循環(huán)（Ornithine-urea cycle，OUC）中關(guān)鍵酶的活性［13-14］，已有研究證實(shí)，許氏齒彈涂魚(yú)（Periophthalmodon schlosseri）是唯一一種具有完整OUC的彈涂魚(yú)，但也只有4.6%的外源性氨被合成尿素［15］。近年來(lái)，一種疑似具有排氨作用的功能性蛋白逐漸被關(guān)注，2017年，Chen等［16］的一篇報(bào)道指出氨氮脅迫會(huì)影響攀鱸（Anabas testudineus）鰓中Rh蛋白（Rhesus-type ammonia transporter）mRNA和蛋白水平高表達(dá)，隨著研究深入，愈來(lái)愈多學(xué)者傾向于認(rèn)為Rh蛋白在排氨過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，且與碳酸酐酶（Carbonic anhydrase，CA）、鈉氫交換蛋白（Na+/H+exchangers，NHE）等存在聯(lián)合作用［17-18］。

作為古老的氣呼吸型魚(yú)類(lèi)，大彈涂魚(yú)（Boleophthalmus pectinirostris）能夠沿著潮汐帶在軟泥中建造洞穴，對(duì)于繁殖季節(jié)洞穴水中高氨的水環(huán)境具有極強(qiáng)的耐受性［19-20］，是研究魚(yú)類(lèi)氨氮環(huán)境耐受性的重要生物學(xué)材料，對(duì)于研究魚(yú)類(lèi)如何提高逆境環(huán)境生存能力也具有重要價(jià)值?；谝延袌?bào)道，本研究側(cè)重于探究大彈涂魚(yú)在氨氮脅迫下是否采用合成無(wú)毒谷氨酰胺這一策略以及是否利用Rh蛋白及其協(xié)同蛋白共同完成持續(xù)排氨，測(cè)定了急性氨氮脅迫條件下大彈涂魚(yú)血氨濃度的變化，檢測(cè)了氨代謝關(guān)鍵酶——谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）在肝臟中的活性及GS基因mRNA表達(dá)量情況；同時(shí)檢測(cè)鰓組織中CA，NHE3蛋白量及氨代謝相關(guān)基因CA15、NHE和Rhcg1的mRNA表達(dá)量情況，旨為魚(yú)類(lèi)氨解毒代謝機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大彈涂魚(yú)購(gòu)自浙江省寧波慈溪市龍山鎮(zhèn)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在寧波大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間每天投喂飼料，并及時(shí)清理糞便和殘餌，配置鹽度為10的海水作為暫養(yǎng)用水，水溫22.2±0.3℃，pH 為 7.61±0.08，溶氧量為 6.38±0.8 mg/L，24 h連續(xù)充氣增氧。7 d后，挑選體質(zhì)健康、大小均勻19.2±0.3 g的大彈涂魚(yú)隨機(jī)分配到6個(gè)塑料養(yǎng)殖桶（93 cm×60 cm×25 cm）內(nèi)，每桶40尾。

1.2 方法

1.2.1 急性氨氮脅迫 參考大彈涂魚(yú)的氨氮脅迫亞致死濃度［21］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)直接向固定體積的海水中添加NH4Cl（分析純，RG≥99.5%，M=53.49）配置出8 mmol/L的NH4Cl鹽溶液為氨氮組實(shí)驗(yàn)用水，以不添加NH4Cl的海水作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)桶，每桶40尾魚(yú)，實(shí)驗(yàn)用水體積固定為8 L使魚(yú)浸沒(méi)在水中，每24 h徹底更換用水，實(shí)驗(yàn)期間不投喂。

1.2.2 樣品采集 在氨氮脅迫后0 h、12 h、24 h、48 h和72 h分別采樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從每桶取3尾魚(yú)。用MS222麻醉后將魚(yú)置于冰面，用無(wú)菌注射器從尾靜脈取血并加入1.5 mL的EP管中，于4℃冰箱中靜置12 h后離心（5000 r/min，4℃，10 min），取上層血清移至新的離心管， 保存于-20℃冰箱備用。抽血后，在冰面上快速解剖取肝、鰓、腎等組織放在1.5mL的EP管并迅速投入液氮中暫存，后儲(chǔ)存于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血氨濃度測(cè)定 血氨測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司，以血清為實(shí)驗(yàn)樣本測(cè)定氨氮組和對(duì)照組的血氨含量，具體操作流程參照說(shuō)明書(shū)，采用美谷分子儀器（上海）有限公司的Molecular Devices SpectraMax-i3x酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm吸光值后，利用如下公式計(jì)算血氨含量：血氨含量（μmol/L）=（（測(cè)定OD-空白OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD））×標(biāo)準(zhǔn)濃度（350 μmol/L）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.2.4 GS 酶活測(cè)定 取肝組織樣，按組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1∶9的比例加入提取液，冰浴勻漿。離心（8000×g，4℃，10 min）取上清，置于冰上用于GS酶活的測(cè)定。GS活性采用索萊寶生物科技有限公司的GS活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定，Molecular Devices SpectraMax-i3x酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm吸光值，計(jì)算求得酶活力值。

1.2.5 CA，NHE3酶聯(lián)免疫（ELISA）分析測(cè)定 取鰓組織樣，磷酸緩沖液（Phosphatic buffer solution，PBS）沖洗后，按組織質(zhì)量（g）：PBS（mL）為1∶9的比例加上預(yù)冷的PBS（50 mmol/L，pH7.4），冰浴勻漿。離心（5000×g，4℃，20 min）收集上清，分裝一份待測(cè)，其余冷凍備用。CA，NHE3活性采用上海研謹(jǐn)生物公司的酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測(cè)試劑盒測(cè)定。Molecular Devices SpectraMax-i3x酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算含量。

1.2.6GS、CA15、NHE和Rhcg1基因mRNA表達(dá)參照NCBI，GenBank中大彈涂魚(yú)GS（XM_020921461），CA15（XM_020925341），NHE（XM_020941797），Rhcg1（KU229861.1） 基 因 cDNA序 列，Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物（表1），分別測(cè)定肝臟中GS基因及鰓組織中CA15，NHE，Rhcg1基因mRNA表達(dá)量。取肝、鰓組織在液氮中研磨成粉末，Trizol試劑提取組織總RNA，沉淀用DEPC溶解，檢測(cè)RNA濃度和A260/A280值，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，凝膠電泳圖像呈單一明亮條帶。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Premix ExTaq試劑于羅氏LightCycler 480上進(jìn)行分析，PCR體系為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，57-61℃（不同引物退火溫度不同）30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s。以β-actin作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)所用熒光定量PCR引物序列

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析工作運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0 做單因素方差分析（one-way ANOVA），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，并根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行LSD或Duncan 多重比較，分析組內(nèi)差異顯著性，用ORIGIN軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫對(duì)血氨濃度的影響

對(duì)照組中大彈涂魚(yú)血清中血氨含量穩(wěn)定在300 μmol/L左右，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的血氨含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；對(duì)于氨氮組，血氨含量隨氨氮脅迫時(shí)間的推移，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在12 h顯著升高并達(dá)到最大值（P＜0.05），隨后在24 h顯著下降并回落到基線(xiàn)附近后，血氨水平再無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。對(duì)照組與氨氮組的血氨含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異（P＜0.05），都表現(xiàn)為氨氮組的血氨含量顯著高于對(duì)照組的血氨含量，尤其在12 h氨氮組的血氨含量為對(duì)照組的4倍，差異極顯著（P＜0.01）（圖1）。

圖1 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)血氨含量的變化

2.2 氨氮脅迫對(duì)肝組織中GS酶活性的影響

在對(duì)照組中，肝臟GS活性在各時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，肝臟GS活性在12 h開(kāi)始出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，并在24 h顯著上升達(dá)到最大值（P＜0.05），隨后GS活性在48 h顯著降低到基準(zhǔn)值附近，直至72 h時(shí)GS活性再無(wú)顯著性變化（圖 2）。

2.3 氨氮脅迫對(duì)鰓中CA，NHE3蛋白含量的影響（ELISA）

2.3.1 對(duì)鰓中CA蛋白含量的影響 在對(duì)照組中，鰓中CA蛋白含量隨時(shí)間變化而波動(dòng)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中CA蛋白含量隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，12 h和24 h時(shí)較0 h的CA蛋白含量顯著升高（P＜0.05），但二者之間并無(wú)明顯差異（P＞0.05），隨后在48 h時(shí)CA蛋白含量進(jìn)一步顯著上升并達(dá)到最大值（P＜0.05），而后CA蛋白含量顯著下降（圖3）

圖2 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)肝組織中谷氨酰胺合成酶活性變化

圖3 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)鰓組織中碳酸酐酶蛋白含量變化

2.3.2 對(duì)鰓中NHE3蛋白含量的影響 在對(duì)照組中，鰓中NHE3蛋白含量隨時(shí)間變化而波動(dòng)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中NHE3蛋白含量在12 h時(shí)有下降趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05），隨著氨氮脅迫時(shí)間的推移NHE3蛋白含量在24 h顯著上升并達(dá)到最大值（P＜0.05），隨后顯著降低并在72 h恢復(fù)到初始蛋白含量附近（圖4）。

2.4 氨氮脅迫對(duì)基因表達(dá)的影響

2.4.1 對(duì)肝中GS基因表達(dá)的影響 在對(duì)照組中，肝臟GS基因的表達(dá)量在12 h顯著上升（P＜0.05）而后趨于平緩的趨勢(shì)，除0 h外，其他時(shí)間點(diǎn)GS基因表達(dá)量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），且均高于0 h 表達(dá)量3倍左右（P＜0.05）；在氨氮組中，肝臟GS基因的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在12 h顯著上升并在48 h進(jìn)一步上升達(dá)到最大值（P＜0.05），隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖5）。

圖4 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)鰓組織中鈉氫交換體蛋白含量變化

圖5 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)肝中GS基因的相對(duì)表達(dá)水平變化

2.4.2 對(duì)鰓中CA15基因mRNA的相對(duì)表達(dá)變化 在對(duì)照組中，鰓中CA15基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升而后下降的波動(dòng)趨勢(shì)，但總體并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中CA15基因的相對(duì)表達(dá)量在24 h內(nèi)有所波動(dòng)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在48 h時(shí)表達(dá)量顯著上升并達(dá)到最大值（P＜0.05），高出0 h基因表達(dá)量2.5倍，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖6）。

圖6 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)鰓中CA15基因的相對(duì)表達(dá)水平變化

2.4.3 對(duì)鰓中NHE基因表達(dá)的影響 在對(duì)照組中，鰓中NHE基因的表達(dá)量對(duì)隨時(shí)間變化而波動(dòng)但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在氨氮組中，鰓中NHE基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在24 h顯著升高并達(dá)到最大值（P＜0.05），隨后，鰓中NHE基因的相對(duì)表達(dá)量在48 h有下降趨勢(shì)，但相對(duì)表達(dá)量與24 h無(wú)顯著性差異（P＞0.05），最終在72 h顯著降低到初始表達(dá)量（P＞0.05）（圖7）。

2.4.4 對(duì)鰓中Rhcg1基因表達(dá)的影響 在對(duì)照組中，鰓中Rhcg1基因的相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間變化而波動(dòng)但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在氨氮組中，鰓中Rhcg1基因的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在48 h顯著上升并達(dá)到最大值（P＜0.05），隨后呈下降趨勢(shì)（圖 8）。

圖7 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)鰓中NHE基因的相對(duì)表達(dá)水平變化

圖8 氨氮脅迫下大彈涂魚(yú)鰓中Rhcg1基因的相對(duì)表達(dá)水平變化

3 討論

3.1 氨氮脅迫對(duì)GS酶活性及其編碼基因表達(dá)量變化的影響

本研究表明，與對(duì)照組相比，急性氨氮脅迫下的大彈涂魚(yú)血清中血氨濃度均有顯著性升高，其中在12 h極顯著升高，為對(duì)照組血清中血氨濃度的4倍。本脅迫實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)添加NH4Cl至8 mmol/L的亞致死濃度［21］而使水體中的氨氮含量提高，高濃度的氨氮會(huì)對(duì)魚(yú)體滲透壓平衡、代謝活動(dòng)造成影響，導(dǎo)致魚(yú)體總氨氮排放量降低，多余氨氮的積累首先影響血氨含量［22］。因此本研究主要探究在亞致死濃度的NH4Cl脅迫下大彈涂魚(yú)的氨氮耐受機(jī)制。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血氨濃度在氨氮脅迫12 h內(nèi)急速升高，隨后在24 h顯著下降并回落到基準(zhǔn)值，直至72 h血氨濃度均無(wú)顯著性差異，表明大彈涂魚(yú)具有一定的氨氮耐受能力，可以通過(guò)某種體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制降低因受氨氮脅迫而升高的血氨濃度。

較早研究認(rèn)為氨氮脅迫下GS活性提高導(dǎo)致的谷氨酰胺積累是造成魚(yú)類(lèi)死亡的關(guān)鍵因素之一，氨氮脅迫下魚(yú)類(lèi)腦組織中的谷氨酰胺積累造成星狀膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，使得顱內(nèi)壓升高，最終導(dǎo)致魚(yú)死亡［23］；但Vander等［24］對(duì)魚(yú)類(lèi)額骨構(gòu)造的分析表明，魚(yú)類(lèi)不同于哺乳動(dòng)物，魚(yú)類(lèi)額骨有較多間隙，能夠耐受較強(qiáng)顱內(nèi)壓。因此，谷氨酰胺的積累并不是造成魚(yú)類(lèi)在氨氮脅迫下死亡的原因，這使得有關(guān)氨氮脅迫為何會(huì)引起谷氨酰胺的積累以及谷氨酰胺的積累在魚(yú)體中發(fā)揮了怎樣的作用等問(wèn)題又重新被重視起來(lái)。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組GS基因表達(dá)量在12 h上調(diào)后再無(wú)顯著性變化，而與其相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組GS酶活性卻沒(méi)有檢測(cè)到顯著性差異，考慮到由基因表達(dá)到蛋白合成是一個(gè)復(fù)雜的修飾與加工的過(guò)程，其中蛋白活化會(huì)受到磷酸化等多種不定因素的影響［25］，酶的活性也會(huì)受到激活因子濃度及活性位點(diǎn)識(shí)別等多方面的影響，因此表現(xiàn)出基因表達(dá)量與酶活性不一致的現(xiàn)象，這也說(shuō)明基因的mRNA豐度與其翻譯產(chǎn)物的表達(dá)量不具有線(xiàn)性關(guān)系［26］；在氨氮脅迫組中大彈涂魚(yú)肝臟GS酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在24 h達(dá)到最大值，與其對(duì)應(yīng)的GS基因表達(dá)量在12 h顯著上升并在48 h進(jìn)一步上升達(dá)到最大值，推測(cè)GS基因表達(dá)量在12 h顯著上升促進(jìn)了GS酶的合成，其酶活性顯著提高并于24 h達(dá)到最大值，而后GS基因在48 h進(jìn)一步上調(diào)卻沒(méi)有引起GS酶活性的上調(diào)，這一現(xiàn)象也可以用mRNA豐度與其翻譯產(chǎn)物的表達(dá)量不具有線(xiàn)性關(guān)系來(lái)解釋?zhuān)?/p>

但氨氮脅迫導(dǎo)致的GS活性及其基因表達(dá)量的一系列變化似乎與大彈涂魚(yú)血氨濃度變化存在一定的關(guān)聯(lián)，可能存在當(dāng)血氨濃度急速上升，GS酶活性提高將NH3和谷氨酸合成了中性、無(wú)毒的谷氨酰胺，從而降低血氨濃度緩解氨對(duì)魚(yú)體的危害，提高了魚(yú)體的氨氮耐受能力。近期研究指出，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）不具備功能性尿素循環(huán)和尿素排泄能力，其在面對(duì)氨氮脅迫時(shí)主要通過(guò)GS將氨和谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，再將谷氨酰胺存儲(chǔ)起來(lái)，待恢復(fù)正常環(huán)境后作為能量來(lái)源調(diào)動(dòng)使用［27］。與其結(jié)果類(lèi)似，

大彈涂魚(yú)同樣不具備功能性尿素排泄能力，推測(cè)大彈涂魚(yú)在受到高氨氮脅迫后，同樣采用合成谷氨酰胺的方式降低內(nèi)源性氨的積累。相關(guān)研究還見(jiàn)于中華烏塘鱧（Bostrichthys sinensis）［28］、金頭鯛（Sparus aurata）［29］等，在導(dǎo)致魚(yú)體氨中毒的不良環(huán)境脅迫下，

均檢測(cè)到GS活性不同程度的上調(diào)。表明大彈涂魚(yú)在氨氮脅迫下通過(guò)GS將氨合成中性、無(wú)毒的谷氨酰胺是其重要的氨代謝途徑之一。

3.2 CA，NHE協(xié)助Rh蛋白進(jìn)行氨的持續(xù)排泄作用

除了被轉(zhuǎn)化成無(wú)毒的谷氨酰胺這一途徑之外，氨廢物還可以通過(guò)鰓組織上的氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排出體外。You等［20］對(duì)大彈涂魚(yú)72 h氨氮脅迫后進(jìn)行了鰓部轉(zhuǎn)錄組組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，脅迫后調(diào)控H+-ATPase酶的mRNA表達(dá)量顯著升高，這一結(jié)果顯示了大彈涂魚(yú)酸排泄與氨氮排泄之間的正相關(guān)關(guān)系。CA是一種含鋅金屬酶，主要催化CO2+H2O?HCO3-+H+這一可逆反應(yīng)［30］。本研究中對(duì)急性氨氮脅迫后的大彈涂魚(yú)鰓組織中CA的蛋白表達(dá)量及其編碼基因CA15的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在48 h時(shí)CA蛋白表達(dá)量及其編碼基因CA15的相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到最大值，推測(cè)在CA作用下提供H+形成酸化層，使NH3質(zhì)子化，協(xié)助Rh蛋白間接參與大彈涂魚(yú)氨排泄過(guò)程。已有研究證實(shí)了作為模式動(dòng)物的斑馬魚(yú)（Brachydanio rerio）鰓部H+-ATPase富集細(xì)胞（HR細(xì)胞）中存在CA特異性表達(dá)位點(diǎn)，表明CA參與了斑馬魚(yú)HR細(xì)胞的酸堿調(diào)節(jié)和Na+攝取這一過(guò)程［31］。盡管已有對(duì)海水魚(yú)鰓部氨排泄功能的研究指出，酸化的邊界層在高度緩沖的海水中的作用是微乎其微的［32］，但對(duì)于離水后在灘涂上進(jìn)行活動(dòng)的大彈涂魚(yú)來(lái)說(shuō)，海水緩沖度降低，通過(guò)CA提供H+可能更有利于將Rh蛋白排出的NH3快速轉(zhuǎn)化形成NH4+，降低氨氮以非離子氨的形式存在而對(duì)魚(yú)體造成強(qiáng)毒性。

相關(guān)研究表明，H+分泌和Na+攝取機(jī)制與Rh蛋白排氨作用的實(shí)現(xiàn)具有功能性相關(guān)［33］。NHE是水環(huán)境和魚(yú)體之間進(jìn)行Na+/H+交換的載體，已經(jīng)在多種魚(yú)鰓組織中檢測(cè)到其交換活性，幾乎所有魚(yú)體外的鈉離子凈流入和體內(nèi)酸根離子的凈流出（H+/NH4+）都是通過(guò)鰓組織中的NHE完成的［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，急性氨氮脅迫下的大彈涂魚(yú)鰓組織中NHE3的蛋白水平在脅迫后24 h顯著升高并達(dá)到最大值，并且直至48 h蛋白表達(dá)量依舊顯著高于初始狀態(tài)，與之相對(duì)應(yīng)的NHE基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，推測(cè)鈉氫交換蛋白可能行使了NH+4的排泄作用。這是由于在正常情況下NHE3行使Na+和H+的交換功能，但當(dāng)魚(yú)體內(nèi)NH4+含量增多時(shí)，推測(cè)可能存在NH4+優(yōu)先于H+通過(guò)NHE3排出體外的趨勢(shì)以增強(qiáng)氨代謝這一功能性。之所以如此推測(cè)是由于在運(yùn)輸生理學(xué)領(lǐng)域通常認(rèn)為小分子質(zhì)量的分子如NH3，CO2是相對(duì)可滲透的，無(wú)需專(zhuān)門(mén)的運(yùn)輸工具或蛋白通道。但Wright等［35］在大彈涂魚(yú)鰓組織中檢測(cè)到了NH4+的活躍排泄位點(diǎn)，提出可能存在一種新的排氨模式，即在Na+/NH4+交換復(fù)合物的作用下進(jìn)行離子氨的排泄，尤其檢測(cè)到NHE2/NHE3表達(dá)量升高，如此更加印證了本研究的推論。而大彈涂魚(yú)體內(nèi)增多的NH4+可能是由于CA作用下提供的H+與NH3結(jié)合形成的，以降低魚(yú)體內(nèi)非離子氨的強(qiáng)氨毒性，因此推測(cè)大彈涂魚(yú)在氨氮脅迫下能通過(guò)NHE3將NH4+排出體外以降低氨毒性。

盡管在眾多研究中表明CA和NHE都與氨代謝功能性相關(guān)，本研究也得到了相似的結(jié)論，但其主要發(fā)揮促進(jìn)NH4+的排泄功能，并不是魚(yú)類(lèi)主要的氨代謝方式。相關(guān)研究指出，魚(yú)類(lèi)主要氨代謝途徑是通過(guò)鰓上皮細(xì)胞將氨氮廢物以NH3的形式排出，而NH3的排出則涉及到氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用［36］，隨著氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Rhesus-type ammonia transporter）具有運(yùn)輸氨的功能被發(fā)現(xiàn)［37］，陸續(xù)在眾多淡水魚(yú)中發(fā)現(xiàn)具有類(lèi)似編碼Rh蛋白的核苷酸序列，如紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）［38］、青斑河豚（Tetraodon nigroviridis）［39］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［40］和紅樹(shù)林鳉魚(yú)（Kryptolebias marmoratus）［41］等。同樣也獲取到了定位在大彈涂魚(yú)鰓上皮細(xì)胞基底側(cè)編碼Rh蛋白的Rhcg1基因的cDNA序列，經(jīng)檢測(cè)，急性氨氮脅迫下的大彈涂魚(yú)鰓組織中Rhcg1基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在48 h達(dá)到最大值，推測(cè)其促進(jìn)了Rh蛋白的加速合成，促進(jìn)氨廢物以NH3的形式通過(guò)氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白持續(xù)排出，從而阻止了血氨濃度的持續(xù)升高。Rh基因以多種形式存在編碼合成Rh蛋白，如Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2等，其中Rhcg1定位于鰓上皮細(xì)胞基底側(cè)，是參與NH3排泄的關(guān)鍵基因，通過(guò)基因敲除技術(shù)獲取無(wú)Rhcg1基因的斑馬魚(yú)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其Rh蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)且對(duì)排氨有顯著抑制作用［42］。對(duì)虹鱒鰓組織中Rhag、Rhbg、Rhcg1和Rhcg2活性位點(diǎn)鑒定分析，提出虹鱒鰓中的Rh蛋白利用酸化的邊界層形成有利的pH梯度，在血氨濃度升高時(shí)促進(jìn)氨的快速代謝，進(jìn)一步明確了Rh蛋白具有NH3氣體排泄通道的作用且酸化層的形成對(duì)氨代謝至關(guān)重要［43］。對(duì)此，本研究推測(cè)大彈涂魚(yú)通過(guò)鰓上皮細(xì)胞基底側(cè)Rhcg1基因的高表達(dá)合成更多的Rh蛋白加快NH3排出，并在CA的作用下，釋放H+協(xié)助Rh蛋白實(shí)現(xiàn)NH3排泄后的質(zhì)子化，降低離子氨對(duì)鰓上皮細(xì)胞的損傷和以NH3形式存在的氨進(jìn)一步擴(kuò)散進(jìn)入魚(yú)體的可能性。同時(shí)，在鰓上皮細(xì)胞內(nèi)，CA釋放H+將膜內(nèi)NH3質(zhì)子化形成NH4+再通過(guò)NHE完成Na+/ NH4+的交換，最終實(shí)現(xiàn)在CA和NHE的共同作用下促進(jìn)Rh蛋白高效排氨。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，急性氨氮脅迫會(huì)導(dǎo)致大彈涂魚(yú)血氨含量顯著升高，但其能迅速降低血氨水平，突出其具有重要的氨代謝途徑以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境而做出適應(yīng)性調(diào)節(jié)的能力?；诎钡{迫下血氨濃度、相關(guān)蛋白活性及表達(dá)量、氨代謝相關(guān)基因mRNA在不同組織中表達(dá)量的變化，推測(cè)大彈涂魚(yú)主要通過(guò)兩種主要方式進(jìn)行氨代謝：一方面是加強(qiáng)氨的排泄，如在鰓上皮細(xì)胞基底外側(cè)膜CA的作用下，釋放H+協(xié)助Rh蛋白實(shí)現(xiàn)NH3排泄后的質(zhì)子化降低氨氮毒性，同時(shí)在鰓上皮細(xì)胞內(nèi)，CA提供H+將NH3質(zhì)子化形成NH4+再通過(guò)NHE完成Na+/ NH4+的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終實(shí)現(xiàn)在CA和NHE的共同作用下促進(jìn)Rh蛋白高效排氨；另一方面是加強(qiáng)氨的轉(zhuǎn)化作用，如通過(guò)肝臟中GS活性的提高加速合成無(wú)毒的中間產(chǎn)物（谷氨酰胺），避免氨在魚(yú)體內(nèi)過(guò)量積累。