岷縣黑裘皮羊微衛(wèi)星多態(tài)性及與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

張瑞 郎俠 吳建平，3 王彩蓮 梁婷玉，3

（1. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730030；2. 甘肅省牛羊種質(zhì)與秸稈飼料化重點實驗室，蘭州 730030；3. 西北師范大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，蘭州 730070；4. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070）

岷縣黑裘皮羊是甘肅省地方裘皮用綿羊品種，以生產(chǎn)黑色二毛裘皮著稱，其主產(chǎn)區(qū)位于甘肅洮河和岷江上游的17個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，境內(nèi)植被覆蓋率高，可食性牧草資源豐富。因此，岷縣黑裘皮羊是在當?shù)鬲毺氐纳鷳B(tài)環(huán)境條件下結(jié)合長期的人工選擇培育而成的［1］。近年來，岷縣黑裘皮羊受產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、禁牧措施實施、雜交育種等因素的影響，分布范圍大幅壓縮，存欄量不斷減少，由上世紀80年代的10萬余只銳減到3000余只［2］，是國家采用搶救性措施保存下來的品種，2006年被列入《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》；2016年被再次列入《全國畜禽遺傳資源保護和利用“十三五”規(guī)劃》瀕危品種。

畜禽遺傳資源不僅是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且是維持生物多樣性，國家生態(tài)安全和農(nóng)業(yè)安全的重要戰(zhàn)略物質(zhì)，因此，保護和利用好畜禽遺傳資源意義重大。而微衛(wèi)星標記是分布于真核生物基因組中、由1-6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成的具有共顯性、數(shù)量多、易檢測、多態(tài)性豐富等特點的分子標記技術(shù)，被認為是理想的可用于評估家畜遺傳多樣性的方法［3］。王斌等［4］通過計算秦巴山區(qū)黃牛群體的遺傳信息、遺傳距離及聚類分析，為研究該品種的遺傳適應(yīng)特點，預(yù)測雜交優(yōu)勢，制定育種戰(zhàn)略等提供了科學依據(jù)；Suh等［5］選取30個位點分析了韓國4個本地牛與荷斯坦和夏洛來牛的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系、遺傳距離及遺傳多樣性，驗證了當?shù)嘏＿z傳資源的獨特性。Tefiel等［6］、Kumar等［7］、王可等［8］和邱小宇等［9］對阿爾及利亞、印度山羊品種、濟寧青山羊等地方綿羊品種的遺傳多樣性做了分析，確定了可用于遺傳標記的位點，豐富了地方綿羊品種的遺傳資源。Fang等［10］和趙思思等［11］分別對中國香豬和河北黑豬品種進行微衛(wèi)星分析，為該地區(qū)豬種質(zhì)資源的合理保護和品種選育提供了依據(jù)。黃勛和等［12］、李紅偉等［13］對我國的烏骨雞和惠陽胡須雞進行了評價，對該品種的選育潛力進行了評價。此外，還有研究表明微衛(wèi)星DNA可作為畜禽育種改良的分子標記。王斌等［14-15］利用12對微衛(wèi)星引物對西鎮(zhèn)牛和宣漢牛生長發(fā)育性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12個位點各基因型與西鎮(zhèn)牛生長發(fā)育性狀具有關(guān)聯(lián)性，而11個位點與宣漢牛生長發(fā)育性狀具有關(guān)聯(lián)性。決肯·阿尼瓦什等［16］、任坤剛等［17］和梁慶玲等［18］用不同微衛(wèi)星位點對巴什拜羊、薩?？搜蚝蜔o角陶賽特羊生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，找到了與各性狀相關(guān)聯(lián)的位點，為該性狀的改良提供了理論依據(jù)。目前，關(guān)于岷縣黑裘皮羊微衛(wèi)星遺傳多樣性與生產(chǎn)性狀間關(guān)聯(lián)效應(yīng)的研究鮮有報道，因此本研究從種質(zhì)資源保護和性狀改良角度出發(fā)，分析了10個微衛(wèi)星位點在岷縣黑裘皮羊群體中的遺傳多樣性，并對所選微衛(wèi)星位點各基因型與體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍的關(guān)聯(lián)性進行分析，以期為該品種的保護和生產(chǎn)性狀改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 根據(jù)數(shù)量遺傳學的抽樣方法，在岷縣黑裘皮羊中心產(chǎn)區(qū)，采用典型群隨機抽樣法，選擇12、24和36月齡各48只，共144只外貌特征明顯、體況相近的岷縣黑裘皮羊，靜脈采血10 mL，裝入有EDTA抗凝劑的真空采血管中，記錄血樣編號，24 h內(nèi)帶回實驗室，-20℃保存，用于后續(xù)試驗。并測定其體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍指標。

1.1.2 設(shè)備與儀器 KOD-201B-KOD-Plus購于東洋紡（上海）生物技術(shù)有限公司；DSMO-100-Liz 500購于克勞寧（北京）生物科技有限公司；蛋白酶K、瓊脂糖、Loading Buffer、DL 2000 Marker均購于天根生化科技（北京）有限公司。

DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；DL9700 TOUCH型PCR儀（北京東林昌盛生物科技有限公司）；5424R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；3730型基因測序儀（美國ABI公司）；JY04S-3C型凝膠成像分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；DY-Ⅲ型高壓電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 微衛(wèi)星DNA多樣性檢測

1.2.1.1 微衛(wèi)星位點的選擇 根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）（http：//www.fao.org）的推薦，選擇10對可用于評價綿羊生產(chǎn)性狀的微衛(wèi)星位點，分別進行5 '端FAM（藍色）、HEX（綠色）、ROX（紅色）、TAMRA（橙色）熒光修飾，引物由武漢金開瑞生物有限公司合成，引物信息見表1。

表110對微衛(wèi)星引物信息

1.2.1.2 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》（第三版），采用常規(guī)酚、氯仿抽提法提取。并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，將符合試驗要求的DNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)總體系為25 μL：10×KOD Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，25 mmol/L MgSO40.5 μL，10 μmol/L Forward 1 μL，10 μmol/L Reverse 1 μL，Template DNA 1 μL，KOD-Plus 1 U，補水至 25 μL。

PCR 擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，65℃-55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，10 個循環(huán)后，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，68℃修復(fù)延伸7 min，于4℃保存。

1.2.1.4 毛細管電泳檢測PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，利用ABI-3730基因測序儀進行毛細管電泳，并對電泳結(jié)果采用Gene Marker進行標準化分析。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)毛細管電泳結(jié)果，將各個位點的等位基因按照片段大小由小到大依次編號為A-O；利用Popgene32軟件計算等位基因頻率（Alleles frequency）、等位基因數(shù)（Numbers of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective numbers of alleles，Ne）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）等；PIC軟件計算多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）。

采用Microsoft Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行整理后，選擇基因型樣本數(shù)≥4的個體，利用SPSS 21.0一般線性模型（GLM）程序，采用最小二乘方差分析微衛(wèi)星位點的基因型對生產(chǎn)性狀影響的效應(yīng)，一般線性模型為：

其中：Yij為個體表型值，μ為群體性狀均值，ai為個體基因型效應(yīng)，bj為個體月齡效應(yīng)，eijk為隨機殘差效應(yīng)。若位點與性狀顯著關(guān)聯(lián)時，運用LSD進行多重比較，若同一位點只有2種基因型，采用獨立性t檢驗分析。P＞0.05表示無顯著差異，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果用“均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取及電泳檢測

提取的樣品DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，所有DNA條帶清晰均勻，亮度較大；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測后，無明顯雜帶，無引物二聚體產(chǎn)生，可用于后續(xù)試驗；利用基因測序儀對每個位點等位基因進行分型，結(jié)果顯示所有電泳圖峰型較完整。圖1所示為3號個體在位點MCM140上177/181 bp基因型，圖2為2號個體在位點OarJMP29上136/136 bp基因型。

2.2 岷縣黑裘皮羊微衛(wèi)星遺傳多樣性分析

岷縣黑裘皮羊10對微衛(wèi)星引物的遺傳多樣性信息見表2。所有位點等位基因數(shù)范圍為9-15，群體平均等位基因數(shù)為11.2個；有效等位基因數(shù)范圍為2.9313-8.2433，群體平均有效等位基因數(shù)為4.4508；觀測雜合度范圍為0.2500-0.7143，群體平均觀測雜合度為0.5218；期望雜合度范圍為0.6658-0.8879，群體平均期望雜合度為0.7657；多態(tài)信息含量范圍為0.6156-0.8673，群體平均多態(tài)信息含量為0.7289。說明岷縣黑裘皮羊具有豐富的遺傳多樣性。

圖13號個體在位點MCM140的檢測結(jié)果

圖22號個體在位點OarJMP29的檢測結(jié)果

2.3 岷縣黑裘皮羊微衛(wèi)星位點與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，位點OarHH47各基因型在12和24月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀間差異無顯著性（P＞0.05）。36月齡時，GG型個體體重顯著高于DD和DI型（P＜0.05）；DD型個體體高顯著低于其它個體（P＜0.05）。

由表4可知，24月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀在位點OarVH72各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。12月齡時，CC型個體體高顯著高于CI型（P＜0.05）。36月齡時，BI型個體體重和胸寬均顯著高于CC、CI和 FI型個體（P＜0.05）。

由表5可知，12和24月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀在位點OarCB226各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。36月齡時，AA和AJ型個體體重顯著高于BB型（P＜0.05）；AJ型個體胸寬顯著高于BB和AA型（P＜0.05），AB型與AJ和BB型間差異無顯著性（P＞0.05）；AJ型個體胸深顯著高于AA和BB型（P＜0.05）。

表210個微衛(wèi)星位點多態(tài)信息

表3 位點OarHH47不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

表4 位點OarVH72不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

表5 位點OarCB226不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

由表6可知，24和36月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀在位點ILSTS28各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。12月齡時，CI型個體體高顯著高于AD、II和JJ型，且顯著高于DJ型（P＜0.05）；胸寬性狀上，CI型個體數(shù)值最大，且顯著大于DJ、II和JJ（P＜0.05），與AD型間無顯著差異性，同時，II型與DJ和JJ型間差異也無顯著性（P＞0.05）。

表6 位點ILSTS28不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

由表7可知，12月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀在位點MCM140各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。24月齡時，EH型個體體高顯著低于EE、EG型（P＜0.05），與FF和GG型間無顯著差異（P＞0.05）；胸圍性狀上，GG型個體顯著高于EG（P＜0.05），與EE、EH和FF型間無顯著差異（P＞0.05）。36月齡時，GG型個體體高顯著低于AF和FF型，與EG型間無顯著差異（P＞0.05）；GG型個體胸圍顯著低于AF、EG和FF型（P＜0.05），AF、EG和FF型間無顯著差異（P＞0.05）。

表7 微衛(wèi)星位點MCM140不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

位點OarFCB193各基因型與岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表8。12月齡時，CC型個體體長和胸圍均顯著高于FF型個體（P＜0.05），與CF型無顯著差異（P＞0.05）。24月齡時，CF型個體體重和胸圍顯著高于FF型（P＜0.05）；體高顯著高于FF和FI型（P＜0.05）。36月齡時，F(xiàn)F型個體體重顯著高于FH型（P＜0.05）；體高、胸寬和胸圍性狀上，F(xiàn)F和FH型個體顯著高于CF型（P＜0.05）。

表8 位點OarFCB193不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

位點OarFCB304各基因型與岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表9。12月齡時，F(xiàn)M型個體體重顯著低于EE和FF型（P＜0.05）；EE型個體胸深顯著高于FF和FM型（P＜0.05）。24月齡時，F(xiàn)F型個體胸深顯著高于EE型（P＜0.05），與CC型無顯著差異（P＞0.05）。36月齡時，EE型個體體長顯著高于CC和FF型，胸寬顯著低于CC和FF型（P＜0.05）。

表9 位點OarFCB304不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

位點OarJMP29各基因型與岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表10。12月齡時，EE型個體在體高和胸深性狀上顯著高于AG型（P＜0.05）。24月齡時，EE型個體體重和胸圍均顯著高于FF型（P＜0.05）。36月齡時，EE型個體體重顯著低于GI型，胸圍顯著高于GI型（P＜0.05）。

表10 位點OarJMP29不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

由表11可知，36月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀在位點MAF70各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。12月齡時，在體重、體高、體長和胸圍性狀上，F(xiàn)J型個體顯著高于DI型（P＜0.05）。24月齡時，DK型個體體高顯著高于DD型（P＜0.05）。

表11 位點MAF70不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

由表12可知，36月齡岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀在位點MAF209各基因型間無顯著差異（P＞0.05）。12月齡時，CC型個體胸深顯著高于DD和DF型（P＜0.05）。24月齡時，體重性狀上，DG和DI型個體數(shù)值最大，且顯著大于AA、CC和DD型（P＜0.05），DD與AA和CC型間無顯著差異（P＞0.05）；體長性狀上，DG型個體顯著高于其它各型（P＜0.05）；胸圍性狀上，DD、DG和DI型個體顯著高于AA、CC和 DF 型（P＜0.05）。

表12 位點MAF209不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀的差異

3 討論

3.1 岷縣黑裘皮羊微衛(wèi)星遺傳多樣性

分析群體遺傳多樣性時，一方面要求所選的樣本量能夠反應(yīng)整個群體，另一方面，選擇合理的微衛(wèi)星位點和數(shù)目對研究群體平均基因多樣性至關(guān)重要。有研究表明［19-20］，當樣本量在25-50時，樣本量與期望雜合度無相關(guān)性，與等位基因數(shù)呈正相關(guān)。本試驗研究的樣本量是144，符合樣本量要求，可以反映整個群體的遺傳多樣性。其次，根據(jù)FAO的建議，所選位點應(yīng)至少有4個及以上的等位基因，一般選擇5-19個為宜，且所選位點要盡可能的均勻分布于不同染色體上。試驗中所選的10個微衛(wèi)星標記，分布于不同染色體，等位基因數(shù)在9-15之間，能夠提供足夠多的遺傳信息，對岷縣黑裘皮羊遺傳多樣性的研究可以提供可靠依據(jù)。

微衛(wèi)星遺傳多樣性不僅可以反映群體的遺傳變異歷史，而且可以為后期的保種選育提供可靠信息。有效等位基因數(shù)值與等位基因數(shù)絕對值的接近程度可以反映等位基因在群體中是否分布均勻，所選的10個微衛(wèi)星位點中，有效等位基因數(shù)和等位基因數(shù)值均相差較大，表明等位基因在該群體中分布不均勻。雜合度是度量群體遺傳變異最合適的參數(shù)之一，平均雜合度的高低可以反映群體的遺傳一致性程度，平均雜合度越高，遺傳變異越大。因觀測雜合度受樣本量影響較大，期望雜合度常被用來衡量群體的遺傳多樣性大小，兩者的接近程度反映人工和自然選擇對群體影響的大小。所選10個標記中，OarCB226位點觀測雜合度和期望雜合度接近程度最高，說明該位點是岷縣黑裘皮羊最原始的等位基因，其它9個位點可能受到了人工和自然的高強度選擇，遺傳變異程度較高。多態(tài)信息含量（PIC）是衡量DNA片段多態(tài)性的指標，Purvis認為PIC大于0.7為最好的遺傳標記［21］。所選10個位點中，7個位點PIC大于0.7，表明所選位點遺傳變異程度較高，可用于評價該群體的遺傳多樣性。

3.2 岷縣黑裘皮羊微衛(wèi)星位點與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性

生產(chǎn)性狀一般認為是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，由于某些基因效應(yīng)微小，很難根據(jù)表型值將其區(qū)分開來，但隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，可以利用DNA標記分析染色體片段或基因座的遺傳規(guī)律來研究基因的效應(yīng)［22］。關(guān)聯(lián)分析是利用基因間的連鎖不平衡，對表型值和基因間的相關(guān)性進行分析，從而鑒定與表型變異相關(guān)的基因位點［23］，在實際應(yīng)用中，根據(jù)王斌等［15］的研究結(jié)果，一般選擇個體數(shù)≥4的基因型進行關(guān)聯(lián)分析。所選10個位點均與生產(chǎn)性狀表現(xiàn)出不同程度的關(guān)聯(lián)性，且出現(xiàn)了幾個位點與同一性狀相關(guān)或一個位點與多個性狀表型值相關(guān)的現(xiàn)象。王玉琴等［24］對太行黑山羊進行微衛(wèi)星位點研究時發(fā)現(xiàn)，位點MAF70的155/155 bp基因型與體重、165/192 bp與體高呈正相關(guān)，劉德穩(wěn)等［25］對魯山牛腿山羊微衛(wèi)星多樣性與體尺性狀的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，MAF70位點159 bp和180 bp對體重具有正效應(yīng)，等位基因144 bp和159 bp對體高、胸深和胸圍具有負效應(yīng)。本研究中，MAF70位點各基因型對36月齡岷縣黑裘皮體尺性狀無顯著影響，但含有等位基因F（140 bp）和J（150 bp）的基因型與12月齡岷縣黑裘皮羊體高、體重、體長和胸圍呈顯著正相關(guān)；含等位基因K（154 bp）的基因型的24月齡岷縣黑裘皮羊體高顯著高于其它各型。

此外，本試驗也發(fā)現(xiàn)了其它與岷縣黑裘皮羊生產(chǎn)性狀具有關(guān)聯(lián)性的位點。其中，12月齡時，與體重相關(guān)的位點有2個：OarFCB304、MAF70；與體高相關(guān)的位點有4個：OarVH72、ILSTS28、OarJMP29、MAF70；與體長相關(guān)的位點有2個：OarFCB193、MAF70；與胸寬相關(guān)的位點有1個：ILSTS28；與胸深相關(guān)的位點有3個：OarFCB304、OarJMP29、MAF209；與胸圍相關(guān)的位點有2個：OarFCB193、MAF70。24月齡時，與體重相關(guān)的位點 有 3個：OarFCB193、OarJMP29、MAF209；與體高相關(guān)的位點有3個：MCM140、OarFCB193、MAF70；與體長相關(guān)的位點有1個：MAF209；與胸寬相關(guān)的位點有0個；與胸深相關(guān)的位點有1個：OarFCB304；與胸圍相關(guān)的位點有4個：MCM140、OarFCB193、OarJMP29、MAF209。36月 齡 時， 與體重相關(guān)的位點有5個：OarHH47、OarVH72、OarCB226、OarFCB193、OarJMP29；與體高相關(guān)的位點有3個：OarHH47、MCM140、OarFCB193；與體長相關(guān)的位點有1個：OarFCB304；與胸寬相關(guān)的位點有4個：OarVH72、OarCB226、OarFCB193、OarFCB304；與胸深相關(guān)的位點有1個：OarCB226；與胸圍相關(guān)的位點有3個：MCM140、OarFCB193、OarJMP29。

4 結(jié)論

本研究所選10個微衛(wèi)星位點在該岷縣黑裘皮羊群體中均具有豐富的遺傳多樣性，且與12、24和36月齡的體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍具有不同程度的關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果從分子水平上為岷縣黑裘皮羊的保種、早期選育和高效育種提供了理論依據(jù)。