梨黑斑病抗病相關(guān)基因PpEMS1的克隆與分析

段敏杰 伊洪偉 王進(jìn) 武崢

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329）

中國(guó)是梨原產(chǎn)國(guó)，也是世界第一產(chǎn)梨大國(guó)，梨產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的2/3，出口量約占世界總出口量的1/6，中國(guó)梨在世界梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的作用［1］。重慶作為砂梨適宜種植區(qū)和長(zhǎng)江流域砂梨主產(chǎn)區(qū)，2018年栽培面積維持在3.6×104hm2，總產(chǎn)量為47.3×105t。在實(shí)際生產(chǎn)栽培中，梨樹受到黑斑病、黑星病、輪紋病、炭疽病等多種真菌性病害的影響，梨樹病害已成為制約世界梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素［2］。其中，梨黑斑病是一種廣泛發(fā)生的世界性病害，尤其是在日本、韓國(guó)和中國(guó)南部砂梨產(chǎn)區(qū)發(fā)病嚴(yán)重［1］。梨黑斑病是由鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌引起的一種病害［3］，主要侵染梨樹葉片、嫩枝和果實(shí)，造成早期落葉、果實(shí)畸形、龜裂，甚至落果，嚴(yán)重影響梨樹產(chǎn)量和梨果品質(zhì)［4］。目前，防治黑斑病的方法主要是使用甲基托布津、多菌靈等化學(xué)藥劑，長(zhǎng)期使用這些化學(xué)藥劑，不僅造成環(huán)境污染，同時(shí)也使部分菌株對(duì)化學(xué)藥劑敏感性降低，防治效果下降。而且，由于梨樹童期長(zhǎng)，遺傳背景復(fù)雜，大部分品種自交不親和等特性，傳統(tǒng)的抗病育種成本高、效率低。通過分子生物學(xué)發(fā)掘梨抗病基因，利用分子抗病育種培育抗病良種可以縮短育種年限，提高育種效率，是解決梨黑斑病危害的有效途徑。

富亮氨酸重復(fù)序列受體樣蛋白激酶（The leucine-rich repeats receptor-like protein kinase，LRRRLK）是植物中已知的最大的一類跨膜類受體蛋白激酶［5］，它由胞外LRR結(jié)構(gòu)域、單次跨膜域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成。1990年，Walker等［6］從玉米中首次發(fā)現(xiàn)LRR-RLK，之后越來(lái)越多的LRR-RLK被挖掘［7］。在擬南芥中，通過測(cè)序分析鑒定出至少223個(gè)LRR-RLKs［8］，其中超過30個(gè)通過遺傳和生化研究確定了其功能［9］。目前，已有研究表明，LRRRLKs的功能主要包括兩個(gè)方面：一是在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用，如形態(tài)發(fā)生、器官形成和激素調(diào)節(jié)；二是參與植物生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)［10］。Kim 等［11］和 Stahl等［12］研究發(fā)現(xiàn)，LRRRLKs中的BRI1、BAK1和CLV1在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中發(fā)揮決定性的作用，而FLS2等其他LRRRLKs基因參與了植物自身防御反應(yīng)［13］。

目前，已通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得梨黑斑病抗病相關(guān)基因，但還需通過抗病基因精細(xì)定位與基因表達(dá)、功能驗(yàn)證等方法相結(jié)合篩選梨黑斑病抗病關(guān)鍵基因。

本研究利用同源基因克隆方法獲得一個(gè)LRRLRK類抗病相關(guān)基因，利用生物信息學(xué)、Southern Blot、亞細(xì)胞定位等方法對(duì)該基因展開分析，同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在梨黑斑病誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究其在梨抗病防御中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

“黃花梨”（Pyrus pyrifolia）、“愛宕梨”（Pyrus pyrifolia）、“翠玉梨”（Pyrus pyrifolia）、“黃冠梨”（Pyrus pyrifolia×Pyrus bretschneideri） 均 來(lái) 自 重 慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所梨資源圃。RNA提取試劑盒（Hipure Total RNA Mini Kit）、DNA提取試劑盒（HiPure SF Plant DNA Maxi Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒（HiPure Plasmid Micro Kit） 等 購(gòu) 自 Magen（ 中國(guó)）。Southern blot試劑盒購(gòu)自Roche（美國(guó)）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）、熒光染料（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）等購(gòu)自TaKaRa（中國(guó)）。PCR試劑、TGEM-T-easy、T4連接酶、大腸桿菌DH5α等購(gòu)自TSINGKE（中國(guó)）。

梨黑斑病病原菌由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所早熟梨課題組分離保存。

1.2 方法

1.2.1PpEMS1全長(zhǎng)CDS的克隆 利用Hipure Total RNA Mini Kit（雙柱法）提取“黃冠梨”葉片總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)白梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用軟件primer5.0設(shè)計(jì)PpEMS1全長(zhǎng)引物PpEMS1-f和PpEMS1-r，以黃冠cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳產(chǎn)物回收后連接TGEM-T-easy載體，并通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，涂布于LB/Amp固體培養(yǎng)基。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并將陽(yáng)性菌液送擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用vector軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，尋找最大開放閱讀框（Open reading frame，ORF）；利用SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用ExPASY網(wǎng)站在線分析蛋白基本性質(zhì)分子量、pI、氨基酸殘基組成、親疏水性等；在線（http：//wolfopsort.org/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；在 線（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）預(yù)測(cè)核定位信號(hào)；利用ClustalX 2.0和MEGA 5.0構(gòu)建PpEMS1與擬南芥部分已知功能LRR-RLKs家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3PpEMS1的表達(dá)分析 采集黃花和愛宕嫩葉，以葉脈為中心，在葉背分別用無(wú)菌針頭創(chuàng)傷后接種梨黑斑病病原菌和無(wú)菌水，放置培養(yǎng)箱中。分別于1、2、3、4、5、6、7和8 d后提取葉片總RNA。

以RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PpEMS1保守序列區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物E1-f和E1-r，以持家基因Actin為內(nèi)參基因，應(yīng)用life technologies公司生產(chǎn)的7500Fast熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)）進(jìn)行熒光定量PCR分析（表1）。

PCR 反應(yīng)體系（12 μL）為 6 μL TB Green Premix Ex Taq、1 μL cDNA、特異引物各 0.3 μL和ddH2O 4.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 3 min ；94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min。

表1 本研究所用引物序列

1.2.4 Southern Blot分析 采集“黃冠梨”、“黃花梨”、“愛宕梨”、“翠玉梨”嫩葉，利用HiPure SF Plant DNA Maxi Kit提取基因組DNA，并用BglⅡ和EcoR V完全酶切。根據(jù)PpEMS1保守序列區(qū)設(shè)計(jì)雜交探針，并與酶切產(chǎn)物在尼龍膜上雜交。探針標(biāo)記、雜交及信號(hào)檢測(cè)等操作均按照雜交試劑盒（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，Roche）說明書進(jìn)行。

1.2.5PpEMS1煙草瞬時(shí)表達(dá)分析 設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)KpnⅠ/BamHⅠ的引物，以測(cè)序正確質(zhì)粒為模板擴(kuò)增PpEMS1，并回收電泳產(chǎn)物。同時(shí)用KpnⅠ/BamHⅠ酶切電泳回收產(chǎn)物和pSAT6-mRFP-N1載體，酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，得到pSAT6-PpEMS1：mRFP-N1融合表達(dá)載體。進(jìn)一步用KpnⅠ/XbaⅠ和KpnⅠ/SpeⅠ對(duì)中間載體Psat6-PpEMS1：mRFP-N1、Psat6-mGFP-N1和植物表達(dá)載體PLGN-35s-nos進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)連接后得到表達(dá)載體PLGN-PpEMS1：mRFP-35s-nos和 PLGN-mGFP-35snos，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取陽(yáng)性克隆單菌落質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。提取農(nóng)桿菌陽(yáng)性單菌落置于kan抗性的LB培養(yǎng)基，放于28℃搖床中震蕩培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速220 r/min。離心后重懸菌體，調(diào)節(jié)OD值至1。采用注射法進(jìn)行本氏煙表皮轉(zhuǎn)化，24℃培養(yǎng)3 d后共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 PpEMS1全長(zhǎng)CDS克隆

根據(jù)PpEMS1的全長(zhǎng)引物PpEMS1-f和PpEMS1-r，以“黃冠”cDNA為模板擴(kuò)增獲得約3800 bp的基因片段（圖1），經(jīng)測(cè)序分析，該基因全長(zhǎng)3894 bp。

圖1 PpEMS1的CDS全長(zhǎng)克隆

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 PpEMS1蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 ExPASY ProtParam tool在線預(yù)測(cè)分析表明，PpEMS1蛋白分子量為140.59 kD；理論等電點(diǎn)為5.42；該蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，Ser、Glu、Pro、Ala等含量較為豐富，Trp含量最少，堿性帶正電荷的氨基酸共128個(gè)，酸性帶負(fù)電荷的氨基酸共100個(gè)，整個(gè)蛋白為帶正電堿性蛋白；半衰期大于10 h；不穩(wěn)定系數(shù)為32.95，屬穩(wěn)定蛋白；平均親水性為0.041，屬親水性蛋白。

2.2.2 PpEMS1蛋白結(jié)構(gòu)域分析 SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示：PpEMS1蛋白激酶除具有引導(dǎo)信號(hào)肽SP外，還包括LRR-RLKs典型的亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（Leucine-rich repeats，LRRs）、單跨膜結(jié)構(gòu)域（Single transmembranous domain，STM）以及激酶活性結(jié)構(gòu)域（Kinase domain，KD），其LRRs屬于胞外LRRs結(jié)構(gòu)（圖2）。說明該蛋白激酶屬于LRR-RLK家族。

2.2.3 PpEMS1蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和NLS預(yù)測(cè) Psort在線預(yù)測(cè)分析顯示該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜的得分最高；NLS預(yù)測(cè)顯示該蛋白激酶氨基酸序列1261-1294處為核定位序列。

2.2.4PpEMS1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過查閱文獻(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）部分已知功能LRR-RLK相關(guān)基因，運(yùn)用MEGA5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），PpEMS1與擬南芥AtEMS1親緣關(guān)系最近，其次是AtBIR1。AtEMS1參與調(diào)控花藥體細(xì)胞及生殖細(xì)胞形態(tài)建成，AtBIR1參與調(diào)控植物抗性相關(guān)信號(hào)通路，與細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)。

圖2 PpEMS1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

圖3 PpEMS1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 PpEMS1的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，“黃花梨”（較耐）和“愛宕梨”（易感）在接種梨黑斑病病原菌1、2、3、4、5、6、7和8 d后，“黃花梨”中，該基因的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后逐漸升高，在6 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，之后逐漸降低；“愛宕梨”中，該基因的表達(dá)基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在4 d的時(shí)候達(dá)到最高點(diǎn)。同時(shí)，4 d之前該基因的表達(dá)量在“愛宕梨”中均高于“黃花梨”，4 d后“黃花梨”中均高于“愛宕梨”（圖 4）。

圖4 “黃花梨”和“愛宕梨”接種梨黑斑病不同時(shí)期后PpEMS1的表達(dá)分析

2.4 PpEMS1的Southern Blot分析

對(duì)“黃冠梨”（HG）、“黃花梨”（HH）、“愛宕梨”（AD）、“翠玉梨”（CY）4個(gè)品種進(jìn)行Southern Blot分析，結(jié)果（圖5）表明，在“黃冠梨”、“黃花梨”、“翠玉梨”中，該基因都以單拷貝形式存在，在“愛宕梨”中以多拷貝形式存在。

2.5 PpEMS1蛋白的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建基因與綠色熒光蛋白GFP的融合表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確融合表達(dá)載體。載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后通過注射法瞬時(shí)侵染本氏煙，注射后培養(yǎng)48 h，對(duì)本氏煙進(jìn)行DAPI染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片中基因的定位情況（圖6）。對(duì)照組中GFP蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞核均存在，試驗(yàn)組融合蛋白熒光信號(hào)在細(xì)胞膜和細(xì)胞核中均有表達(dá)。

圖5 PpEMS1的Southern Blot分析

圖6 PpEMS1蛋白激酶的亞細(xì)胞定位

3 討論

本研究從“黃冠梨”克隆獲得一個(gè)預(yù)測(cè)為富亮氨酸重復(fù)序列受體樣蛋白激酶EMS1的基因，暫命名為PpEMS1。Southern blot分析表明，在“黃花梨”、“翠玉梨”、“黃冠梨”中，該基因都以單拷貝形式存在，在“愛宕梨”中以多拷貝形式存在。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該基因受梨黑斑病誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。該蛋白激酶具有一段NLS，亞細(xì)胞定位顯示融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核均有表達(dá)，推測(cè)該蛋白激酶合成后可能分別在質(zhì)膜和核膜發(fā)揮作用。

黑斑病病原菌可以在花期和果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期通過各種途徑潛伏侵染，也可以通過氣孔和傷口侵染葉片，對(duì)果實(shí)和葉片造成傷害。當(dāng)病原菌侵入健康的植物細(xì)胞和組織后，寄主植物細(xì)胞的正常生理功能遭到破壞，病原菌不僅奪取寄主植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分，同時(shí)還給植物施加機(jī)械壓力并產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，如酶、毒素等，使植株產(chǎn)生病癥。病原菌要侵入植物內(nèi)，必須克服植物細(xì)胞壁的障礙，病原菌通過產(chǎn)生降解酶穿透細(xì)胞壁，破壞寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于病原菌侵入。

已有多項(xiàng)研究表明，受體蛋白激酶參與植物的抗病防御過程。Song等［14］研究表明，水稻Xa21對(duì)水稻黃單胞菌具有抗病作用；在擬南芥中，F(xiàn)LS2與細(xì)菌鞭毛蛋白的感知有關(guān)［15］；富亮氨酸重復(fù)序列受體蛋白激酶BIR2是植物免疫系統(tǒng)中BAK1的負(fù)調(diào)控因子［16］；NIK1參與了植物抗病毒免疫反應(yīng)過程［17］。

在擬南芥中，EMS1受體蛋白激酶被證實(shí)與小孢子細(xì)胞及絨氈層細(xì)胞分化有關(guān)，EMS1通過信號(hào)調(diào)節(jié)控制生殖細(xì)胞和周邊體細(xì)胞的命運(yùn)［18］。在柑橘中，EMS受體蛋白激酶受柑橘潰瘍病誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)該蛋白激酶可能參與植物的抗病防御過程［19］。目前只鑒定出少數(shù)LRR-RLKs類蛋白激酶的配體，TPD1是EMS1蛋白激酶的一種小富半胱氨酸蛋白配體［20］，可以與EMS1相互作用，誘導(dǎo)EMS1磷酸化，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)一些列生理生化反應(yīng)［21］。研究表明，擬南芥β-碳酸酐酶（βCAs）是EMS1激酶的下游互作蛋白，其中βCA1和βCA4協(xié)同EPF2和CO2響應(yīng)分泌蛋白共同調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育和運(yùn)動(dòng)［22-23］。在植物木質(zhì)部纖維中，富亮氨酸重復(fù)序列受體樣蛋白激酶PXC1參與了植物細(xì)胞壁的形成［24］，EMS1與細(xì)胞分化相關(guān)，它是否也參與到植物次生細(xì)胞壁的形成，并在病原菌侵染細(xì)胞壁時(shí)發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從“黃冠梨”中克隆獲得一個(gè)LRR-RLK家族基因PpEMS1，它以不同拷貝數(shù)存在于不同梨基因組中，其蛋白作為跨膜蛋白，主要在細(xì)胞膜發(fā)揮作用，可能參與了梨黑斑病抗病防御過程。