馬鈴薯St4CL的克隆及表達分析

謝海娟 范希德 葉廣繼，2 周云，2 王艦，2 楊永智，2

（1. 青海大學，西寧 810016；2. 青海省農(nóng)林科學院青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室 青藏高原生物技術(shù)教育部重點實驗室 青海省馬鈴薯育種重點實驗室，西寧 810016）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是繼小麥、水稻、玉米之后全球第四大糧食作物，深受人們喜愛［1］。隨著經(jīng)濟發(fā)展，逐步機械化是收獲馬鈴薯的發(fā)展方向，但在馬鈴薯收獲、裝運和貯藏等一系列過程中造成薯塊不同程度的機械損傷，使薯塊的腐爛速度加快，為貯藏帶來不便。因此，增加薯塊的機械強度及其受損后的愈合能力顯得尤為重要［2］。

4-香豆素輔酶A連接酶（4CL）是苯丙氨酸類化合物合成中不可缺少的酶，它能夠活化香豆酸及其衍生物生成相應的硫代酯，這些酯類化合物是合成黃酮類化合物、異黃酮類化合物、木質(zhì)素類化合物、花青素類化合物、香豆素化合物、二苯乙烯類化合物的中間體［3-5］。其中，木質(zhì)素是植物組織的重要結(jié)構(gòu)成分，它賦予植物機械強度，并保護植物免受各種致病菌的侵害［6］。

目前，4CL已在許多植物中被克隆，存在于一個小的基因家族中，有2-5名成員［7］。擬南芥中4CL有4個成員，均在苯丙氨酸代謝途徑中具有重疊而獨特的作用，其中，At4CL1和At4CL2是植物正常生長所必需的［8］。4CL在水稻中有5個成員，其中Os4CL2在花藥中特異表達并在紫外光照射下被強烈激活，可能參與黃酮類化合物的形成［9］。楊樹中的Pt4CL1主要參與木質(zhì)部組織中木質(zhì)素的生物合成，而Pt4CL2與其他類苯丙烷的形成有關(guān)［10］。木質(zhì)素含量與植物莖稈的抗倒伏有關(guān)，過表達Mu4CL15的香蕉中木質(zhì)素含量高于野生型，并且轉(zhuǎn)基因植株莖桿的物理強度顯著增強［11］。

目前，馬鈴薯4CL的研究主要集中在苯丙氨酸類化合物合成方面，尚不清楚苯丙氨酸類化合物在馬鈴薯抗晚疫病中的作用，對馬鈴薯St4CL開展深入研究，有助于我們進一步了解其作用機理。本研究采用同源克隆方法，以青海省主栽品種青薯9號為材料，克隆St4CL，進行生物信息學分析，通過熒光定量分析St4CL在馬鈴薯青薯9號不同組織和不同品種中的表達情況，以期為St4CL的功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯品種L1192-4、青薯2號、青薯9號、青薯10號、青薯11號、下寨65、隴薯6號、隴薯7號均由青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所提供，其特性見表1。

RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆載體PLB以及DNA凝膠回收試劑盒等購自天根公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、高保真聚合酶以及熒光定量檢測試劑盒等購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1St4CL的克隆 提取馬鈴薯青薯9號塊莖總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄。以青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異基因4CL序列為參考，設(shè)計引物St4CL-F和St4CL-R（表2），進行PCR擴增。PCR 反應體系為 2×FastTaq PCR Master Mix 10 μL、引物 各 0.5 μL、cDNA 2 μL 和 ddH2O 7 μL。PCR 擴增程序為 95℃ 3 min ；95℃ 20 s，71℃ 20 s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目的條帶，與PLB載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，涂板于含有氨芐（Amp）的LB培養(yǎng)基上，37℃過夜。挑取單克隆篩選陽性，送上海生工公司測序。

表1 馬鈴薯品種特性

1.2.2St4CL的生物信息學分析 采用DNAMAN軟件拼接St4CL測序序列，利用ExPAsy-ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）和 SOPMA（https：//npsa_sopma.html）等在線工具對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)進行預測。采用Psort prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）和 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線工具預測亞細胞定位和分析啟動子。采用NCBI數(shù)據(jù)庫以及DNA MAN軟件分析氨基酸序列，利用MEGA6.0軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 青薯9號不同組織中St4CL的表達 待青薯9號長出塊莖后，分別取其根、莖、葉、花、匍匐莖、塊莖，提取RNA并進行熒光定量分析，3個重復，將反轉(zhuǎn)錄cDNA濃度稀釋至200 ng/μL。熒光反應體系為 10 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、0.4 μL qPCR4CL-F、0.4 μL qPCR4CL-R、2 μL cDNA 和 7.2μL ddH2O。反應程序為兩步法：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 32 s，共40個循環(huán)。每個組織反應重復3次，采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 不同馬鈴薯品種中St4CL的表達分析 分別將L1192-4（紫色）、青薯2號、青薯9號、青薯10號、青薯11號、下寨65、隴薯6號、隴薯7號種于花盆中，各3盆，待其出苗1個月，取其嫩葉，參照1.2.3進行熒光定量PCR分析。

表2 試驗所用引物名稱和序列

2 結(jié)果

2.1 青薯9號中St4CL的克隆

以馬鈴薯青薯9號塊莖的cDNA為模板進行PCR擴增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，獲得一條大小為1800 bp左右的條帶（圖1），與預期大小一致。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，St4CL的CDS長度為1710 bp，編碼569個氨基酸。

2.2 St4CL的生物信息學分析

2.2.1 St4CL蛋白的理化性質(zhì)St4CL的CDS長度為1710 bp，編碼569個氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量約為61.83 kD，等電點為5.53，分子式為C2782H4430N726O825S18，其中含量最高為丙氨酸（Ala），占8.6%，含量最低為色氨酸（Trp），占0.2%，不含吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。該蛋白的平均疏水性（GEAVY）為0.068，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為34.68，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白。

圖1 馬鈴薯St4CL的檢測

2.2.2 St4CL蛋白的亞細胞定位與二級結(jié)構(gòu)分析 亞細胞定位預測結(jié)果顯示，該蛋白定位在葉綠體的類囊體膜上。St4CL蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由4種構(gòu)象組成，分別為無規(guī)則卷曲（Cc）、α-螺旋（Hh）、延伸連（Ee）、β-折疊（Tt），其中，無規(guī)則卷曲占比例最高為43.76%，含有249個氨基酸，β-折疊占比例最低為7.56%，含有43個氨基酸。

2.2.3St4CL的啟動子順式作用元件的分析 使用Plant Care對St4CL基因起始密碼子上游1500 bp處的啟動子序列進行分析發(fā)現(xiàn)（表3），除了包含轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基本元件之外，還含有多種與逆境響應相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸響應元件、厭氧誘導元件、赤霉素響應元件以及與干旱和黃酮類生物合成相關(guān)的MYB結(jié)合位點。

2.2.4 St4CL蛋白的序列比對以及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 使用DNAMAN軟件對St4CL、番茄、甜辣椒以及煙草的4CL蛋白進行比對（圖2），發(fā)現(xiàn)St4CL蛋白與番茄（NP_001333794.1）、甜辣椒（XP_016564135.1）、 煙 草（XP_019244483.1） 的4CL蛋白相似性分別達到97%、93%和90.67%，并具有2個高度保守基序BoxⅠ（SSGTTGLPKGV）和BoxⅡ（GEICIRG）。使用MEGA6.0采用鄰近法對St4CL蛋白及其他不同植物中的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，St4CL蛋白和番茄、甜辣椒、煙草聚在一個分支，其中馬鈴薯與番茄的親緣關(guān)系最近，與棉花、柑橘的親緣關(guān)系較遠。

表3 St4CL的啟動子順式作用元件的分析

2.3 St4CL基因的RNA-seq數(shù)據(jù)分析

經(jīng)分析青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所RNA-seq數(shù)據(jù)（圖4）發(fā)現(xiàn)，當青薯9號受到晚疫病侵染時，St4CL的表達呈下降-上升-下降的趨勢，但整體呈下降趨勢，說明該基因可能響應晚疫病菌的脅迫。

2.4 青薯9號不同組織中St4CL的表達

通過對青薯9號不同組織中St4CL的表達進行qRT-PCR分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，該基因在青薯9號各組織中均有不同程度的表達，具有明顯的組織特異性，其中，葉片中的表達量最高，花次之，而根中的表達量最低。

2.5 不同馬鈴薯品種中St4CL的表達

為進一步了解St4CL在不同馬鈴薯品種中的表達情況，對其進行qRT-PCR分析（圖6），發(fā)現(xiàn)St4CL在青薯10號中表達量最高，L1192-4次之，青薯2號與下寨65表達量最低。

3 討論

4CL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，廣泛存在于各種植物中，主要是與調(diào)控木質(zhì)素的合成有關(guān)［12］。本研究采用同源克隆方法獲得了馬鈴薯青薯9號4CL同源基因的CDS序列，命名為St4CL，其CDS長度為1710 bp，編碼569個氨基酸。利用生物信息學對所獲得的St4CL氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的平均疏水性（GEAVY）為0.068，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為34.68，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白。亞細胞定位表明，該蛋白位于葉綠體的類囊體膜上，但可信度為80.7%，后續(xù)需要進一步進行驗證。多序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有植物中4CL蛋白所共有的2個肽基序BoxⅠ和BoxⅡ，其中BoxⅠ是4CL催化反應中能夠與AMP結(jié)合的功能域，而BoxⅡ中心的Cys殘基被認為直接參與催化反應［13］。系統(tǒng)進化分析表明，St4CL蛋白與番茄、甜辣椒、煙草等茄科植物的親緣關(guān)系較近，與柑橘、棉花、毛白楊等非茄科的親緣關(guān)系較遠。Alberstein等［14］發(fā)現(xiàn)，番茄中的4CL蛋白與木質(zhì)素合成有關(guān)，當其與查爾酮合成酶結(jié)合時能夠生成柚皮素。4CL在被炭疽病菌侵染的未成熟甜辣椒果實中的表達上調(diào)，從而來誘導果實中咖啡基-5-羥色胺的合成［15］。茉莉酸甲酯和創(chuàng)傷能夠誘導煙草中Nt4CL表達，從而調(diào)節(jié)植株發(fā)育過程［16］。不同發(fā)育階段中棉花的Gh4CL1表達量不同，在開花后15 d和20 d的表達量較高，說明該基因調(diào)控棉花纖維細胞伸長［17］。啟動子分析表明，St4CL啟動子區(qū)域含有多種與逆境響應相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸響應元件、赤霉素響應元件以及與干旱和黃酮類生物合成相關(guān)的MYB結(jié)合位點，說明該啟動子元件具有多樣性，可以為進一步研究St4CL的表達特點提供基礎(chǔ)。李萌等［18］研究白樺4CL啟動子的表達發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過瞬時侵染的白樺莖段被染成藍色，說明其可能參與白樺木質(zhì)部的發(fā)育。

圖2 4CL氨基酸多重序列比對

圖3 St4CL與相關(guān)植物4CL同源蛋白的系統(tǒng)進化分析

圖4 St4CL的RNA-seq數(shù)據(jù)分析

圖5 St4CL在青薯9號不同組織中的表達

圖6 St4CL在不同品種中的表達

眾多研究表明，4CL表達具有組織特異性，如柑橘中的Cit4CL1在幼果中的表達最高，根中最低，Cit4CL2在幼莖中表達最高，根中最低，而Cit4CL3卻在根中表達最高，幼莖與幼果中最低［19］，桂花中的4CL在花瓣中的表達量最高，并且不同花期該基因的表達量不同，導致花青素含量也不同［20］，維管束植物卷柏中的Sm4CL1和Sm4CL2均在根中的表達最高，其中Sm4CL2參與對羥基苯基和愈瘡木脂素亞基的生物合成［21］。陳夏曄等［22］研究發(fā)現(xiàn)，Nt4CL在煙草葉片中高表達，而研究煙草葉片中高表達基因?qū)档蜔熑~木質(zhì)素含量和煙草危害性具有重要意義。賈彩虹等［23］研究表明，將反義4CL基因轉(zhuǎn)入毛白楊中并測定木質(zhì)素含量，轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素含量低于對照41.37%。將刺槐GRP1.8啟動子與從毛白楊中克隆的反義4CL連接構(gòu)建融合基因并轉(zhuǎn)入煙草發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素的含量較野生型平均降低了13.7%［24］。為確定St4CL在青薯9號中的組織表達特性，本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測其在各組織中的表達情況。結(jié)果顯示St4CL在葉片和紫花中的表達量最高，在根中的表達較低，且系統(tǒng)進化樹分析表明St4CL與煙草4CL親緣關(guān)系較近，推測該基因不僅花青素的合成有關(guān)，可能還與木質(zhì)素的合成有關(guān)。

晚疫病是導致馬鈴薯產(chǎn)量下降的重要原因之一，該病是由致病疫霉菌侵染引起，F(xiàn)ritzemeier等［25］發(fā)現(xiàn)，用致病疫霉菌Pi1和Pi4分別侵染含有抗晚疫病Pi1的馬鈴薯葉片發(fā)現(xiàn)，兩組葉片中4CL表達量急劇增加后又急劇下降，但受Pi1感染的葉片中4CL表達量急劇下降后又開始增加，而受Pi4感染的葉片中4CL表達下降后趨于穩(wěn)定。通過對青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所前期RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，4CL為晚疫病差異基因，當其受到晚疫病脅迫后，該基因的表達先下降后上升再下降，這可能是由于本實驗選擇的材料本身對晚疫病具有一定的抗病性。通過實時熒光定量PCR技術(shù)對St4CL在不同馬鈴薯品種中的表達量進行測定發(fā)現(xiàn)，該基因在L1192-4中表達較高，由于L1192-4品種馬鈴薯為紫色，該基因與花青素合成相關(guān)而使其表達量升高。張蕾等［26］采用RNAi技術(shù)將草莓果實中Fa4CL沉默后對果實中的花色素苷進行測定發(fā)現(xiàn)，花色素苷含量明顯降低。St4CL在高抗晚疫病品種青薯10號中表達最高，在感病品種下寨65中的表達量最低，從尹軍良［27］與青海省農(nóng)林科學院生物技術(shù)研究所晚疫病抗性試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯晚疫病田間抗性青薯10號＞隴薯7號＞青薯9號＞隴薯6號＞青薯11號＞青薯2號＞下寨65。而且4CL參與香豆素合成途徑，與其他苯丙烷類代謝物質(zhì)一樣，具有許多生物學功能，能夠抵御多種病原菌對植物的侵害，增強植物抗病性，棉花中Gh4CL參與了棉花對鏈格孢菌的抗性反應［28］。推測4CL不僅與苯丙氨酸類化合物合成相關(guān)而且與晚疫病菌的抗性相關(guān)。目前在茄科植物中關(guān)于4CL的研究主要在煙草上，對馬鈴薯中4CL相關(guān)報道較少，克隆St4CL可以進一步為研究馬鈴薯中苯丙烷代謝與晚疫病抗性研究等過程提供幫助。目前，已構(gòu)建St4CL的表達載體，為明確St4CL在馬鈴薯中的功能和作用機制提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功克隆了馬鈴薯St4CL的CDS區(qū)，St4CL是穩(wěn)定的疏水性蛋白，主要分布在葉綠體的類囊體膜上，啟動子中含有許多逆境響應元件。推測St4CL不僅參與木質(zhì)素和花青素合成，還可能參與馬鈴薯抗晚疫病。