SPME-GC-MS 法分析淡豆豉發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)化

隋利強(qiáng)，李 鷙，高 琳，許 文，徐 偉?，褚克丹?

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350122；2.福建咸康藥業(yè)有限公司，福建 福州350026）

淡豆豉是由豆科植物大豆Glycine max（L.）Meorr.的成熟種子和青蒿、桑葉經(jīng)發(fā)酵加工而成的制品，具有解表除煩、宣發(fā)郁熱等功效，具有抗氧化、降低膽固醇、保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種生物活性，可用于腫瘤、心腦血管、骨質(zhì)疏松癥等疾病的預(yù)防和治療，為藥食兩用品種［1-3］。福州地區(qū)淡豆豉發(fā)酵時(shí)需將桑葉、青蒿煎煮，煎液拌入凈大豆中，蒸透后，稍涼，在25～28 ℃，相對(duì)濕度80% 左右的條件下發(fā)酵至黃衣上遍，取出，洗凈，曬干。在淡豆豉制備過(guò)程中，青蒿和桑葉作為共同發(fā)酵的基質(zhì)，其中某些成分被分解和利用轉(zhuǎn)化成其他有效成分，部分成分也可以刺激菌絲生長(zhǎng)和生物活性物質(zhì)產(chǎn)生［4］。

淡豆豉發(fā)酵過(guò)程伴隨著多種化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，目前已知，淡豆豉發(fā)酵過(guò)程變化最為明顯的是黃酮苷類，如大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷會(huì)轉(zhuǎn)化為大豆苷元、染料木素、黃豆黃素，此外，淡豆豉發(fā)酵過(guò)程還產(chǎn)生一種具有溶栓作用的纖溶酶［5］。淡豆豉發(fā)酵過(guò)程的揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)化未見(jiàn)報(bào)道。

在前期實(shí)驗(yàn)中，觀察到淡豆豉經(jīng)發(fā)酵后氣味變化明顯，推測(cè)與揮發(fā)性成分變化有關(guān)。但是淡豆豉揮發(fā)性成分含有量較低，無(wú)法用常規(guī)方法進(jìn)行分析，固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)技術(shù)，適用于揮發(fā)性成分含有量低的物質(zhì)的檢測(cè)［6-9］。本實(shí)驗(yàn)采用SPME-GC-MS 法分析淡豆豉發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分的轉(zhuǎn)化，以期為其炮制原理研究提供參考。

1 材料

全二維氣相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Leco 公司）。黑豆由咸康藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車蘇容副教授鑒定為豆科植物大豆Glycine m ax（L.）Meorr.的成熟種子。桑葉、青蒿由咸康藥業(yè)提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車蘇容副教授鑒定桑葉為桑科植物桑Morus albaL.的干燥葉，青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分。淡豆豉為咸康藥業(yè)有限公司上述同批原料制備的成品，收集5批樣品，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車蘇容副教授鑒定為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)性成分提取 分別精密稱取2.0 g 黑豆、淡豆豉、桑葉、青蒿粉末于100 mL 的頂空瓶中，快速密封，并將其置于恒溫水浴的設(shè)備中，90 ℃下預(yù)熱30 min。將老化過(guò)的65 μm PDMS／DVB 的固相微萃取伸入到頂空瓶中，推出萃取頭，再頂空萃取60 min，將固相微萃取的裝置迅速伸入GC-MS 進(jìn)樣口，于250 ℃下脫附5 min 進(jìn)行分析。萃取樣品前，萃取頭均應(yīng)在250 ℃下老化15 min［10-11］。

2.2 GC-MS 分析

2.2.1 GC-MS 條件 DB-5MS 石英彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不采用分流進(jìn)樣；程序升溫（50 ℃的溫度保持2 min，再以3.0 ℃／min的速度升溫至220 ℃，保持4 min）；體積流量1 mL／min；解析4 min［12-14］。

電離方式EI；電子能量70 ev；離子源230 ℃；接口230 ℃；溶劑延遲時(shí)間3.0 min；質(zhì)量掃描范圍m／z30～550。

2.2.2 GC-MS 分析 按“2.2.1”項(xiàng)下方法分析收集揮發(fā)性成分，通過(guò)GC-MS 分析并檢索比對(duì)NIST Version1.7圖譜庫(kù)，鑒定出各樣品的化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法求得各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。見(jiàn)表1。

表1 各樣品揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3 討論

通過(guò)SPME-GC-MS 分析鑒定的化合物主要為烷烴類、酯類、醛類、酚類等。其中黑豆、淡豆豉、桑葉、青蒿中分別檢測(cè)出揮發(fā)性成分84、72、80、84種。其中，黑豆與淡豆豉共有成分20種，黑豆獨(dú)有成分52種，淡豆豉獨(dú)有成分40種。經(jīng)淡豆豉與黑豆揮發(fā)性成分比較，發(fā)現(xiàn)淡豆豉發(fā)酵過(guò)程出現(xiàn)差異成分中，12種差異成分來(lái)自桑葉和青蒿，另外40種差異成分與發(fā)酵過(guò)程有關(guān)。對(duì)福建咸康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的5批淡豆豉進(jìn)行分析，上述結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性較好。維恩圖見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品揮發(fā)性成分分布維恩圖

淡豆豉發(fā)酵過(guò)程，揮發(fā)性成分變化較大，棕櫚酸、氧化喇叭烯、β-金合歡烯、β-芹子烯等經(jīng)發(fā)酵后消失，也產(chǎn)生出新物質(zhì)如α-蒎烯、氧化香橙烯、β-法尼烯、α-芹子烯等。黑豆中的β-芹子烯，淡豆豉中的α-芹子烯互為同分異構(gòu)體，可能與發(fā)酵轉(zhuǎn)化相關(guān)。其中，發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的東莨菪內(nèi)酯可保護(hù)肝纖維化大鼠肝臟，改善大鼠肝纖維化病變過(guò)程，具有抗肝纖維化作用［15］；發(fā)酵過(guò)程含有量明顯增加的丹皮酚藥理活性廣泛，可干預(yù)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成，具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等活性［16］。其中，抗炎、鎮(zhèn)痛作用與淡豆豉的解熱，用于治療感冒、寒熱頭痛。

青蒿中檢測(cè)到脫氧青蒿素含有量為0.893%，3-脫氧雙氫青蒿素含有量為0.317%，而淡豆豉中檢測(cè)到脫氧青蒿素含有量為0.966%，高于青蒿中的含有量，3-脫氧雙氫青蒿素在淡豆豉中未檢測(cè)到。淡豆豉中脫氧青蒿素含有量的升高，推測(cè)原因?yàn)榈刽袚]發(fā)性成分種類和含有量較青蒿稍少，脫氧青蒿素在同等含有量下含有量可能會(huì)升高；再者發(fā)酵過(guò)程中青蒿素類成分可能發(fā)生轉(zhuǎn)化，如3-脫氧雙氫青蒿素轉(zhuǎn)化為脫氧青蒿素。3-脫氧雙氫青蒿素在豆豉中未檢測(cè)到，可能在制備輔料過(guò)程中，3-脫氧雙氫青蒿素流失；且發(fā)酵過(guò)程3-雙氫青蒿素可能發(fā)生轉(zhuǎn)化。上述推測(cè)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。青蒿入藥可清熱、解暑、截瘧、涼血、利尿、健胃、止盜汗?？杉鍦?、入丸散口服，也可搗敷或研磨調(diào)敷外用。青蒿素類成分是青蒿中非常重要的一類藥效成分，具有抗瘧、抗腫瘤、抑菌殺蟲(chóng)、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抑制脂肪變性等作用，還可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，而湯劑對(duì)青蒿素類成分的利用率較低［17-18］。若改變淡豆豉的服藥途徑，如以丸、散劑的形式服用有可能更好的發(fā)揮青蒿中青蒿素類成分的作用。

本研究通過(guò)頂空固相微萃取法提取淡豆豉原料及成品的揮發(fā)性成分，GC-MS 進(jìn)行成分分析，檢測(cè)到淡豆豉發(fā)酵過(guò)程中部分揮發(fā)性成分的轉(zhuǎn)化，由于毛細(xì)管內(nèi)部涂層和萃取纖維頭的選擇性，所測(cè)化合物數(shù)量和種類只能反應(yīng)大部分淡豆豉發(fā)酵過(guò)程的揮發(fā)性成分的轉(zhuǎn)化，少數(shù)化合物可能在該萃取條件和檢測(cè)條件下無(wú)法測(cè)得。如果要全面反應(yīng)淡豆豉發(fā)酵過(guò)程的揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)化，可嘗試不同類型涂層的毛細(xì)管和纖維萃取頭，獲得更全面的信息。此外，可結(jié)合LC-MS 等分析方法對(duì)淡豆豉發(fā)酵過(guò)程成分轉(zhuǎn)化進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討淡豆豉發(fā)酵炮制原理。