化瘀消癥顆粒對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8／SVneo 侵襲遷移的影響

孫建華郜 潔劉開飛王焱皙李麗芳 鄧高丕?

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦兒中心，廣東 廣州510405；3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510515；4.寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川750021）

異位妊娠是指受精卵在子宮體腔以外著床［1］，發(fā)生率約為2%［2］。因輸卵管妊娠破裂導(dǎo)致的死亡占所有妊娠相關(guān)疾病死亡的2.7%，是出血性疾病死亡的首要因素［3］。輸卵管是異位妊娠最常見的種植部位，90%以上的異位妊娠發(fā)生在輸卵管［1］。西醫(yī)對輸卵管妊娠的管理包括手術(shù)治療、藥物治療和期待療法［4］。手術(shù)治療可造成生育功能破壞、輸卵管或盆腔組織粘連等，同時(shí)經(jīng)濟(jì)花費(fèi)較高［5］。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作為輸卵管妊娠治療的一線藥物［5］，可導(dǎo)致惡心、嘔吐、骨髓抑制、甚至死亡等嚴(yán)重的并發(fā)癥［4］。期待療法的成功率則非常依賴于病例選擇［4］。中藥保守治療符合用藥標(biāo)準(zhǔn)的輸卵管妊娠，往往能取得良好的臨床療效，同時(shí)保留了患者的生育功能?；鱿Y顆粒用于輔助治療早期輸卵管妊娠少腹血瘀證，是課題組總結(jié)、整理、優(yōu)化開發(fā)的廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移是輸卵管妊娠進(jìn)展和最終導(dǎo)致輸卵管破裂的重要因素［6］。Integrin β3／FAK 通路為介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤遷移的重要通路，本研究從該通路出發(fā)，探討化瘀消癥顆粒的殺胚機(jī)制，為后續(xù)臨床應(yīng)用和深入基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 化瘀消癥顆粒由丹參、赤芍、桃仁、紫草、天花粉組成，為廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑（粵藥制字Z20170001），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備，經(jīng)水提過濾、減壓濃縮，最終制備為凍干粉。用RPMI-1640將其配制成20 g ／L 儲(chǔ)存液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝凍存于-20 ℃冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要稀釋至所需濃度。

1.2 細(xì)胞株 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8／SVneo 購買于美國ATCC 細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心。

1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% 胰酶、雙抗（青霉素-鏈霉素）（美國Gibco 公司）；PBS（美國Hyclone 公司）；CCK8試劑盒（日本同仁公司）；結(jié)晶紫染色液、RIPA（強(qiáng)）裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；4%多聚甲醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；Matrigel Matrix 基質(zhì)膠、Transwell 小室（美國BD 公 司）；integrin β3、E-cadherin、p-FAK、Src、p-Src、GAPDH 美國CST 公司），黏著斑激酶（FAK 美國Abcam 公司）；二抗（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光液（美國Bio-rad 公司）；RNA 提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit）、qPCR 試劑 盒（Maxima SYBR Green qPCR Master Mix）（美國Thermo 公司）；PCR引物設(shè)計(jì)及合成（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司），常溫離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）；生物安全柜（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Nexcelom 公司）；超微量分光光度計(jì)（德國Lmplen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄合成儀、凝膠成像系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增儀、電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-rad 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用8%的FBS（含1%雙抗）在5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至90%進(jìn)行細(xì)胞傳代或種板，具體方法如下：吸棄原培養(yǎng)液，用PBS 輕輕漂洗細(xì)胞，吸棄PBS 加入適量0.25% 的胰酶，37 ℃消化2 min，加入8%的FBS 終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其懸浮，收集細(xì)胞懸液至15 mL 離心管進(jìn)行離心（500 r／min，5 min），棄上清用8% FBS 重懸細(xì)胞，混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用合適的細(xì)胞密度進(jìn)行傳代或中板。

2.2 CCK8檢測HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后接種至96孔板（1×104／孔），每孔100 μL，貼壁24 h 進(jìn)行加藥干預(yù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同濃度化瘀消癥顆粒組（0.125、0.25、0.5、1、2 g／L）、陽性對照組（0.08 ng／L甲氨蝶呤）、對照組，分別培養(yǎng)12、24、48 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK8繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=［（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）／（OD對照組-OD空白組）］×100%。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將6孔板底部水平畫線，取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后接種至板上（4×105／孔），每孔2 mL。分組為化瘀消癥顆粒組（0.5 g／L）、對照組、陽性對照組?；鱿Y顆粒濃度由CCK8實(shí)驗(yàn)確定，化瘀消癥顆干預(yù)細(xì)胞48 h 半數(shù)抑制濃度（IC50）對應(yīng)的中藥濃度。細(xì)胞融合約至90%，用200 μL 槍頭垂直用力劃痕，PBS 漂洗，按分組加入設(shè)定濃度的藥物溶液并拍照。24 h后再次拍照觀察各組細(xì)胞遷移距離。

2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 將matrigel 基質(zhì)膠放于4 ℃過夜，用RPMI 1640培養(yǎng)液以1 ∶8稀釋基質(zhì)膠，取80 μL 平鋪于Transwell 小室中，37 ℃孵育過夜，使膠凝固。種板前用RPMI 1640培養(yǎng)液水化30 min。采用取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后接種至Transwell 小室（2×104個(gè)／孔），每孔200 μL（1% FBS）。分組為化瘀消癥顆粒高、中、低劑量組（0.5、0.4、0.3 g／L）、對照組、陽性對照組。下室每孔加750 μL 10%的FBS，37 ℃培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，用4% 多聚甲醛固定15 min，甲醇透化5 min，0.1%結(jié)晶紫藍(lán)染色15 mim。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞穿過小室基質(zhì)膠的情況，并拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 qRT-PCR 檢測細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá) 分組及干預(yù)同2.4項(xiàng)，采用Mazol 法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行濃度和純度測定，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)。PCR 引物序列為E-cadherin引物，正向5’ -GAAAACAGCAAAGGGCTTGGA-3’，反向5′-TGGGGGCTTCATTCACATCC-3′；integrin β3引 物，正 向5′-TTGGAGACACGGTGAGCTTC-3′，反 向 5′-TTAGGTTCAGCTTGGGCCTG-3′。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃，1 0 min。95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃10 s；共40個(gè)循環(huán)。在65～95 ℃之間每0.5 ℃為升溫單位采集繪制溶解曲線。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2—△△Ct值計(jì)算目的基因表達(dá)量。

2.6 Western blot 檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 分組及干預(yù)同2.4項(xiàng)，干預(yù)24 h 后用RIPA 裂解細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白濃度后加入loading buffer 進(jìn)行煮沸變性。上樣，電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1～2 h 后敷相應(yīng)一抗（目的蛋白抗體1 ∶500～1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜；ECL 化學(xué)發(fā)光后經(jīng)凝膠成像儀顯影；Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。采用目的蛋白條帶灰度值／GAPDH 或磷酸化蛋白／總蛋白條帶灰度值計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0及graphpad prism 6.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊采用LSD 進(jìn)行兩兩比較，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖的影響 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞活性的抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性。見圖1。

圖1 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞增殖的影響（n=3）

3.2 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞遷移的影響 化瘀消癥顆粒、甲氨蝶呤干預(yù)HTR-8／SVneo 細(xì)胞24 h 后，對照組HTR-8／SVneo 細(xì)胞向劃痕處遷移，化瘀消癥顆粒組劃痕面積較對照組變化較小。見圖2。

3.3 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞侵襲的影響 化瘀消癥顆粒、MTX 干預(yù)HTR-8／SVneo 細(xì)胞24 h 后，與對照組比較，化瘀消癥顆粒（0.4、0.5 g／L）可顯著抑制體外HTR-8／SVneo 細(xì)胞侵襲能力（P＜0.01），并呈濃度依賴性。與陽性對照組比較，化瘀消癥顆粒0.5 g／L 組侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01）。見圖3。

圖2 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞遷移的影響

圖3 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞侵襲能力的影響（n=3）

3.4 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞integrin β3、EcadherinmRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較，化瘀消癥顆粒（0.3、0.4、0.5 g／L）明顯下調(diào)integrin β3 mRNA 表達(dá)，上調(diào)E-cadherinmRNA 表達(dá)（P＜0.05）。見圖4。

圖4 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞integrin β3、 E-cadherin mRNA 表達(dá)的影響（n=3）

3.5 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞integrinβ3、p-FAK、p-Src、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，化瘀消癥顆粒（0.4、0.5 g／L）E-cadherin 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），integrinβ3及p-FAK 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；化瘀消癥顆粒（0.3、0.4、0.5 g／L）p-Src 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）。見圖5。

4 討論

圖5 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細(xì)胞E-cadherin、integrin β3、p-FAK、p-Src 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

在早期胚胎種植過程中，從胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞（cytotrophoblast，CTB）到絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（extra-villous trophoblast，EVT）轉(zhuǎn)化是胎盤植入的基本過程，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲過程類似于腫瘤細(xì)胞［7］。絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞黏附于子宮后，部分間質(zhì)化形成EVT，從而獲得了侵襲遷移的能力，使得EVT 穿過子宮上皮細(xì)胞基底膜并向間質(zhì)及其動(dòng)脈浸潤［7-8］。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞黏附于子宮后的生理過程涉及對基底膜或細(xì)胞外基質(zhì)成分的附著、降解，并在被降解成分中遷移。在輸卵管妊娠中，EVT 侵襲和繼而發(fā)生的胎盤形成和正常宮內(nèi)妊娠有很多相似性［9-10］。

整合素屬于黏附分子家族，是由α 和β 亞基靠非共價(jià)鍵連接而成的異二聚體跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、基質(zhì)與細(xì)胞間的黏附［11］。Integrinβ3和細(xì)胞外基質(zhì)分子結(jié)合可以激活包括侵襲、遷移、增殖、存活等在內(nèi)的各種通路［11-12］。研究表明，Integrinβ3表達(dá)缺陷可以削弱滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，使滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足，從而促使先兆子癇形成［13］。黏著斑激酶是胞內(nèi)信號蛋白非受體酪氨酸激酶，位于整合素富集的黏著斑處，與細(xì)胞黏附和遷移密切相關(guān)［14-15］。FAK 有6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中Tyr397位點(diǎn)是自磷酸化位點(diǎn)，其激活才能使FAK 結(jié)合原癌基因Src的位點(diǎn)暴露并與之結(jié)合從而使FAK 完全磷酸化，活化的FAK 和Src 復(fù)合物通過作用于其他蛋白激活下游信號通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞不同的功能［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，整合素／FAK 信號通路在細(xì)胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮著重要作用［16］，F(xiàn)AK／src 信號通路亦和滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移密切相關(guān)，抑制FAK／Src 信號通路可以明顯減弱滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移作用，從而影響早孕 胚胎種植［17］。黏附分子Ecadherin 是參與上皮間質(zhì)化及侵襲遷移的重要蛋白［18］，有研究對孕早期胎盤中CTB 和EVT 進(jìn)行配對，并用PCR 探針比較相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明在EVT 中E-cadherin 表達(dá)是下調(diào)的［18］，側(cè)面反映其低表達(dá)水平可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移。

化瘀消癥顆粒中丹參、桃仁、赤芍、活血祛瘀止痛，并具有抗腫瘤之功［19-22］。紫草涼血活血，可抑制小鼠早期胚胎發(fā)育［23］。天花粉同具抑制腫瘤和抗生育之效［24-25］。本研究從侵襲遷移的角度，進(jìn)一步探討化瘀消癥顆粒的作用機(jī)制。

課題組前期對體外培養(yǎng)的輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞與正常宮內(nèi)早孕滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者增值能力、生長周期、外觀形態(tài)及侵襲能力相似［26-27］，故本研究選用人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8／SVneo 細(xì)胞為載體細(xì)胞進(jìn)行化瘀消癥顆粒作用機(jī)制探索。

本實(shí)驗(yàn)采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測高、中、低劑量的化瘀消癥顆粒對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果提示和陰性對照組相比，化瘀消癥顆粒組及陽性對照MTX 組中滋養(yǎng)細(xì)胞遷移距離均減小。Transwell 實(shí)驗(yàn)表明高、中、低劑量的化瘀消癥顆粒均可抑制HTR-8／SVneo 細(xì)胞侵襲，并呈劑量依賴型，高劑量組抑制作用優(yōu)于陽性對照組。qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果表明，化瘀消癥顆?？梢蕴岣逧-cadherin mRNA 和蛋白表達(dá)，降低integrin β3 mRNA 和蛋白表達(dá)及FAK、Src 的磷酸化水平。本研究提示化瘀消癥顆?？赡芡ㄟ^抑制integrin β3／FAK 信號通路抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移。

綜上所述，化瘀消癥顆粒能抑制HTR-8／SVneo 細(xì)胞侵襲和遷移，其殺胚機(jī)制可能和調(diào)節(jié)整合素β3／FAK／Src 信號通路有關(guān)。