二丁顆粒HPLC 指紋圖譜建立及5種成分測(cè)定

梁梓敏，覃潔萍，郭海姣

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530001）

二丁顆粒為2015年版《中國藥典》 收載的中藥成方制劑，由紫花地丁、半邊蓮、蒲公英、板藍(lán)根4味藥材組成，功效清熱解毒，用于火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風(fēng)熱火眼［1］，可治療痤瘡、慢性支氣管炎、急性咽炎等［2-7］。目前，藥典中二丁顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)僅為秦皮乙素［1］；近來有學(xué)者報(bào)道了其中單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、菊苣酸3種成分含有量的測(cè)定方法［8］，但仍未能對(duì)制劑整體質(zhì)量進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，如表告依春為板藍(lán)根主要有效成分，具有很強(qiáng)的抗病毒活性［9-10］，但目前并無相關(guān)報(bào)道。

單咖啡?；剖?、咖啡酸、菊苣酸等酚酸類成分具有抑病毒、抑菌、抗炎、抗氧化等藥理作用［11-12］，秦皮乙素具有抗炎、抗腫瘤作 用［13-15］，為二丁顆粒藥效成分。因此，本實(shí)驗(yàn)建立二丁顆粒HPLC 指紋圖譜，并測(cè)定表告依春、單咖啡?；剖?、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配置UV 型紫外檢測(cè)器、安捷倫工作站（美國安捷倫公司）；密思博超純水器；SQP 電子分析天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；TGL-16G 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ5200B 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 紫花地?。ㄅ?hào)20180501）、板藍(lán)根（批號(hào)20180101）、蒲公英（批號(hào)20180201）、半邊蓮（批號(hào)20180201）均由南寧市景昌中藥飲片有限公司提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室蔡毅教授鑒定為正品。表告依春（批號(hào)171206）、單咖啡酰 基酒 石（批號(hào)171130）、菊苣酸（批號(hào)171130）對(duì)照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；秦皮乙素（批號(hào)110741-200102）、咖啡酸（批號(hào)110885-201708）對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院），含有量均大于98%。二丁顆粒共10批，批號(hào)171193（20 g／袋），購自四川古藺肝蘇藥業(yè)有限公司；批 號(hào) 180120（20 g／袋）、180401（20 g／袋）、181410D（20 g／袋）、180604D（無糖，4 g／袋）、180317（20 g／袋），購自修正藥業(yè)集團(tuán)長春高新制藥有限公司；批 號(hào)180911（無 糖，4 g／袋）、180918（無 糖，4 g／袋）、180903（20 g／袋）、180926（20 g／袋），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室制備。

甲醇、乙腈為色譜純；乙醇等其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4.0 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，5%～10% A；12～20 min，10% A；20～30 min，10%～17%A；30～50 min，17%～24% A）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長242 nm（0～12 min）、330 nm（12～50 min）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，置于5個(gè)10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，制得貯備液，取適量置于同一量瓶中，甲醇稀釋，制成分別含表告依春、單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜?、咖啡酸、菊苣酸10.8、60.4、111、11.1、28.0 μg／mL，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取相當(dāng)于原藥材2～5 g的顆粒適量，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入40 mL 60%乙醇回流45 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)?0%乙醇溶解并定容至10 mL，13 000 r／min離心，取上清液過微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝制備缺紫花地丁、板藍(lán)根、蒲公英、半邊蓮的其他藥材各1份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取顆粒（批號(hào)180926）2.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL 測(cè)定。以4號(hào)峰（秦皮乙素）保留時(shí)間和色譜峰面積為參照，測(cè)得其余10個(gè)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.03%～0.17%之間，相對(duì)峰面積RSD在0.27%～2.8%之間，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)180926），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次。以4號(hào)峰（秦皮乙素）保留時(shí)間和色譜峰面積為參照，測(cè)得其余10個(gè)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.05%～0.29%之間，相對(duì)峰面積RSD 在0.37%～2.0%之間，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒（批號(hào)180926）2.5 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL 測(cè)定。以4號(hào)峰（秦皮乙素）保留時(shí)間和色譜峰面積為參照，測(cè)得其余10個(gè)峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.02%～0.13% 之間，相對(duì)峰面積RSD在0.30%～1.6% 之間，表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.3.4 建立方法 取10批顆粒適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1，再采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版）對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11個(gè)共有峰（圖2），其中4號(hào)峰為秦皮乙素，是君藥紫花地丁主要活性成分，該色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高，保留時(shí)間適宜，故選擇其為參照峰。相似度見表1，可知各批樣品相似度均在0.90以上，表明指標(biāo)成分一致性較好。

圖1 10批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

圖2 HPLC 指紋圖譜共有峰Fig.2 Common peaks of HPLC fingerprints

表1 10批樣品相似度Tab.2 Similarities of ten batches of samples

2.3.5 特征峰歸屬 精密吸取表告依春、單咖啡?；剖?、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)記錄色譜圖和各色譜峰紫外吸收光譜，并與指紋圖譜共有模式中共有特征峰進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)共有模式中2～5、9號(hào)特征峰的保留時(shí)間及其紫外光譜分別與表告依春、單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸對(duì)照品一致，故確認(rèn)為相應(yīng)成分。然后，精密吸取缺紫花地丁、蒲公英、半邊蓮、板藍(lán)根陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，并與顆粒指紋圖譜共有模式中共有特征峰進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖3，可知1、8號(hào)峰為4種藥材共有特征峰，2號(hào)峰（表告依春）歸屬為板藍(lán)根，4號(hào)峰（秦皮乙素）、7號(hào)峰歸屬為紫花地丁，3號(hào)峰（單咖啡?；剖幔?號(hào)峰（咖啡酸）、9號(hào)峰（菊苣酸）歸屬為蒲公英，6、10～11號(hào)峰歸屬為半邊蓮。

圖3 二丁顆粒及陰性樣品HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of Erding Granules and negative samples

2.4 含有量測(cè)定

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖4。由圖可知，對(duì)照品、供試品色譜圖相應(yīng)位置具有相同保留時(shí)間色譜峰，陰性無干擾，理論塔板數(shù)以秦皮乙素（3號(hào)峰）計(jì)應(yīng)不少于6 000。

2.4.2 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品貯備液適量，逐級(jí)稀釋制成分別含表告依春、單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸2.16～86.2、12.1～133、22.1～244、2.22～24.4、5.60～61.6 μg／mL 的溶液，各精密吸取5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，測(cè)得表告依春、單咖啡?；剖?、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸峰面積RSD 分別為0.77%、1.0%、0.97%、1.1%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)180926），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL，測(cè)得表告依春、單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸峰面積RSD 分別為 0.39%、0.44%、0.34%、0.60%、0.82%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)180926）6份，每份2.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL，測(cè)得表告依春、單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜?、咖啡酸、菊苣酸含有量RSD 分別為1.2%、1.6%、1.2%、1.5%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含有量已知的樣品（批號(hào)180926）1.25 g，共6份，精密加入含表告依春（0.040 4 mg／mL）、單咖啡酰基酒石酸（0.401 mg／mL）、秦皮乙素（0.686 mg／mL）、咖啡酸（0.066 6 mg／mL）、菊苣酸（0.269 mg／mL）對(duì)照品溶液各1.00 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣5 μL測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4.7 樣品含有量測(cè)定 精密稱取相當(dāng)于原藥材2～5 g 的不同批號(hào)顆粒粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL 測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n=2）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=2）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.08%磷酸、乙腈-0.12%磷酸流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸洗脫時(shí)各成分色譜峰分離度較好，而且出峰時(shí)間適中；考察 了Agilent Poroshell 120 EC-C18（250 mm ×4.6 mm，4.0 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（4.6 mm × 250 mm，5.0 μm）、Phenomenex Gemini-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，發(fā)現(xiàn)Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱分離度、峰形、柱效較好；考察了柱溫25、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)分離度、峰形較好；考察了體積流量0.8、1.0、1.2 mL／min，發(fā)現(xiàn)1.0 mL／min 時(shí)洗脫效果較好；采用DAD 檢測(cè)器在190～400 nm 波長處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)表告依春、單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜?、咖啡酸、菊苣酸最佳吸收波長分別為242、330、344、322、330 nm，為了使各成分均能獲得盡可能高的測(cè)量靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用雙波長切換時(shí)間序列采樣方式進(jìn)行檢測(cè)，即0～12 min 242 nm，12～50 min 330 nm，發(fā)現(xiàn)在此條件下各成分吸收及峰型較理想，并可達(dá)到良好的分離效果。綜上所述，最優(yōu)色譜條件為Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，4.0 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長242、330 nm；柱溫30 ℃。

3.2 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、30%甲醇、60% 甲醇、水、乙醇、30% 乙醇、60% 乙醇、40%甲醇（含1% 乙酸）［12］、70% 甲醇（含5% 甲酸）［16］，發(fā)現(xiàn)以60%乙醇為提取溶劑時(shí)各成分綜合提取率最高；考察了冷浸、超聲、回流提取，發(fā)現(xiàn)回流提取效率明顯優(yōu)于超聲提取與冷浸提??；考察了25、40、55 mL 提取溶劑體積及15、30、45、60、90 min 提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)40 mL、45 min 時(shí)各成分基本提取完全。綜上所述，最優(yōu)提取條件為40 mL 60%乙醇回流提取45 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立二丁顆粒HPLC 指紋圖譜，并測(cè)定表告依春、單咖啡?；剖?、秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸含有量，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜專屬性較強(qiáng)，測(cè)定方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，對(duì)提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有著積極的參考意義。