T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義*

王偉杰， 彭根遠(yuǎn)， 姜 韜， 張寧妹， 李 ?！?/p>

(寧夏醫(yī)科大學(xué) 1總醫(yī)院結(jié)直腸外科， 2臨床醫(yī)學(xué)院， 3總醫(yī)院病理科， 寧夏 銀川 750004)

基于免疫檢查點(diǎn)的免疫治療是腫瘤治療的一線手段，目前研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞膜表面存在程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)的高表達(dá)，同時(shí)在腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞存在PD-1的高表達(dá)，兩者結(jié)合可以封閉免疫細(xì)胞的殺傷作用，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡[1-2]，而目前PD-1/PD-L1信號(hào)已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的主要靶點(diǎn)。T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域(T-cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是2009年鑒定出的一種類似免疫檢查點(diǎn)蛋白，是表達(dá)在T細(xì)胞和NK細(xì)胞上的抑制性受體，TIGIT具有多種配體，包括CD155、CD112和CD113，而CD155和CD122同時(shí)也是CD226的配體。CD226與TIGIT競(jìng)爭(zhēng)，刺激T細(xì)胞活性。配體與TIGIT之間的相互作用占了上風(fēng)，使CD226免疫活性受到抑制。腫瘤細(xì)胞上調(diào)CD155和CD122以逃避免疫介導(dǎo)的破壞作用。上述配體中CD155與TIGIT的親和力最高，2者結(jié)合后可以發(fā)揮類似免疫抑制作用，但是目前TIGIT/CD155的研究尚未廣泛[3-4]，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，TIGIT在黑色素瘤等腫瘤中高表達(dá)[5]。

結(jié)直腸癌作為一種高發(fā)性的實(shí)體瘤，目前發(fā)病率逐年升高。結(jié)直腸癌的治療主要采用外科手術(shù)、放化療和生物免疫治療等綜合性治療方式，也有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中存在負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號(hào)的高表達(dá)，包括PD1/PD-L1和CD40/CD40L等，該類信號(hào)的高表達(dá)直接抑制了淋巴細(xì)胞的免疫殺傷功能[6-7]，目前TIGIT/CD155在結(jié)直腸癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中TIGIT/CD155的表達(dá)水平，并探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為結(jié)直腸癌免疫治療提供新思路。

材 料 和 方 法

1 病例來(lái)源

選擇2016年1月～2018年6月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院收治的80例結(jié)直腸癌患者，患者在接受腸鏡-病理檢測(cè)確診為結(jié)直腸癌，接受手術(shù)切除后獲得相關(guān)腫瘤組織及癌旁正常組織。患者在接受治療前未經(jīng)過(guò)放療和化療等治療，經(jīng)過(guò)病理確診為腺癌組織，80例患者中男性49人，女性31人，患者年齡44～76歲，平均58歲。經(jīng)過(guò)診斷，按照《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017版)》進(jìn)行病理分期(pTNM)，其中I期28人、II期26人、III期22人，IV期4人。同時(shí)收集患者癌旁正常組織，癌旁組織是距離腫瘤組織5 cm以上的腸黏膜組織?；颊呔橥?。

2 方法

2.1免疫組織化學(xué)染色法 將腫瘤組織和癌旁組織用3.7%的中性甲醛固定，脫水后采用石蠟包埋，進(jìn)行4 μm厚度的連續(xù)切片。切片經(jīng)過(guò)脫蠟水化后用3%雙氧水浸泡，37 ℃浸泡30 min后煮沸5 min， 后采用羊血清封閉30 min，37 ℃水浴15 min后，滴加抗TIGIT抗體(Abcam，工作濃度為1 ∶200)和抗CD155抗體(Abcam，工作濃度為1 ∶ 150)孵育過(guò)夜后清洗，繼續(xù)滴加 II 抗，37 ℃水浴30 min后加入辣根過(guò)氧化物酶，37 ℃水浴30 min，PBS洗2次后加入DAB試劑盒顯色，蘇木精染色，切片進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、封片。以PBS代替I抗作為對(duì)照。TIGIT和CD155陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞膜，少量表達(dá)在胞質(zhì)內(nèi)。染色結(jié)果以Birner法進(jìn)行評(píng)分，綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)染色者為0分、染色淺但明顯區(qū)別于陰性對(duì)照為1分，染色深為2分；陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)百分比的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞率低于5%的為0分，5%～25%細(xì)胞陽(yáng)性率為1分，26%～50%細(xì)胞陽(yáng)性率為2分，大于50%為3分。以上兩者積分相乘后，0分為陰性染色，1～3分為陽(yáng)性染色，4～5分為強(qiáng)陽(yáng)性染色。

2.2Western blot法檢測(cè)TIGIT和CD155的表達(dá)水平 將100 mg的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織用無(wú)菌手術(shù)剪剪碎后加入1.0 mL的RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)在冰上裂解30 min，10 000×g轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液以BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，根據(jù)分子量不同分別配制8～12%的SDS-PAGE凝膠，取蛋白液后用5× loading buffer補(bǔ)充體積至20 μL，煮沸8 min后進(jìn)行電泳，80 V電壓電泳，之后轉(zhuǎn)換為120 V繼續(xù)電泳，將凝膠去除后進(jìn)行PVDF膜的轉(zhuǎn)膜，采用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜0.5～2 h，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST稀釋 I 抗，抗TIGIT和CD155抗體(Abcam)的稀釋比例為1∶500/1 ∶800，I 抗孵育后PVDF膜用TBST洗2次后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗孵育(Abcam)， II 抗的稀釋比例為1 ∶20 000。孵育完成后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行吸光度的分析，以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白吸光度值的比值表示。

2.3ELISA法檢測(cè)TIGIT和CD155的表達(dá)水平 按照上述方法提取腫瘤組織和癌旁組織中的蛋白，BCA法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白濃度的檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，相關(guān)性分析采用Pearson分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TIGIT和CD155在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

TIGIT和CD155在癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.8%(7/80)和18.8%(15/80)，而在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.8%(63/80)和83.8%(67/80)。TIGIT在癌旁組織中表達(dá)均為陽(yáng)性染色，而腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為28例，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為35例，而CD155在癌旁組織中表達(dá)均為陽(yáng)性染色，腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)為30例，強(qiáng)陽(yáng)性為37例。TIGIT和CD155在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.01)。染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of TIGIT and CD155 in colon cancer tissues was detected by immunohistochemical staining (×200).

圖1 TIGIT和CD155在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

2 結(jié)直腸癌及癌旁組織中TIGIT和CD155蛋白的表達(dá)水平

Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TIGIT和CD155的表達(dá)水平隨著病理分期的增高而增高，且TIGIT和CD155的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.867，P<0.01)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2.Relative protein expression of TIGIT and CD155 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsphase I group;#P<0.05vsphase II group;△P<0.05vsphase III group.

圖2 Western blot法檢測(cè)TIGIT和CD155蛋白的表達(dá)水平

3 結(jié)直腸癌組織中TIGIT和CD155的表達(dá)水平與臨床病理-生理因素的相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌組織中TIGIT和CD155陽(yáng)性表達(dá)率與患者的年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05),與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化及病理分期具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表1。腫瘤較大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度低及病理分期較高的患者出現(xiàn)TIGTT和CD155強(qiáng)陽(yáng)性比例高，而腫瘤較小、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度高及病理分期低的患者強(qiáng)陽(yáng)性比例低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 3.The protein expression of TIGIT and CD155 was detected by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsphase I group;#P<0.05vsphase II group;△P<0.05vsphase III group.

圖3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)檢測(cè)TIGIT和CD155蛋白的表達(dá)水平

討 論

TIGIT是I型跨膜蛋白，在細(xì)胞外區(qū)有免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)含有ITIM結(jié)構(gòu)域，是2008年被鑒定發(fā)現(xiàn)的，而TIGIT在T細(xì)胞上的功能是最早被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的，TIGIT高表達(dá)于CD45RO+T細(xì)胞上，Naive T細(xì)胞經(jīng)過(guò)CD3/CD28抗體刺激后可以上調(diào)TIGIT[8-9]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TIGIT缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的病理狀況加劇，機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)TIGIT的缺失導(dǎo)致MOG肽段免疫后T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)，這揭示了TIGIT是一種T細(xì)胞的抑制性受體[10]。目前認(rèn)為T(mén)IGIT對(duì)T細(xì)胞的抑制功能主要是通過(guò)2條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，一種是TIGIT作用于T細(xì)胞自身，通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞抗原受體α(T cell receptor α, TCRα)鏈的作用抑制TCR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，一種是通過(guò)觸發(fā)抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC)上的配體PVR下游信號(hào)，增強(qiáng)信號(hào)分子ERK磷酸化水平，增強(qiáng)APC分泌抗炎因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10, IL-10)的表達(dá)，同時(shí)IL-10繼續(xù)作用T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答[11-12]。

表1 結(jié)直腸癌組織中TIGIT和CD155的表達(dá)水平與臨床病理-生理特征的關(guān)系

Table 1.Relationship between TIGIT and CD155 and clinicopathological and physiological characteristics in colorectal cancer (%)

The indexnTIGIT positiveP CD155 positivePGender Male4938 (77.6)>0.141 (83.7)>0.25 Female3125 (80.6)26 (83.8)Age (year) ≤604636 (78.3)>0.2538 (82.6)>0.1 >603427 (79.4)29 (85.3)Differentiation of tumors High and medium differentiation2915 (51.7)<0.0121 (72.4)<0.01 Low differentiation5148 (91.1)46 (90.2)Lymph node metastasis No3013 (43.3)<0.0118 (60.0)<0.01 Yes5050 (100.0)49 (98.0)Tumor diameter (cm) ≤53118 (58.1)<0.0120 (64.5)<0.01 >54945 (91.8)46 (93.9)Tumor staging Phase I～I(xiàn)I5437(68.5)<0.0142 (77.8)<0.01 Phase III～I(xiàn)V2626 (100.0)25 (96.2)

表2 結(jié)直腸癌組織中TIGIT和CD155強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理-生理特征的相關(guān)性分析

Table 2.The correlation between strong positive expression of TIGIT and CD155 and clinicopathological-physiological characteristics in colorectal cancer (%)

The indexTIGIT positive (n)TIGIT strongly positive (n)PCD155positive (n)CD155strongly positive (n)PDifferentiation of tumors High and medium differentiation3817 (44.7)<0.0121 8 (38.1)<0.01 Low differentiation2518 (72.0)4629 (63.0)Lymph node metastasis No13 6 (46.2)<0.0518 7 (38.9)<0.01 Yes5029 (58.0)4930 (61.2)Tumor diameter (cm) ≤53710 (27.0)<0.054217 (40.1)<0.01 >52625 (96.2)2520 (80.0)

研究表明，某些腫瘤組織中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)與預(yù)后相關(guān)，NK細(xì)胞的重要功能是參與細(xì)胞免疫、腫瘤免疫和病毒感染等過(guò)程。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞的數(shù)目在機(jī)體腫瘤免疫中有著重要的作用[13]，Ishigami等[14]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中浸潤(rùn)的NK細(xì)胞比例在高浸潤(rùn)組中顯著高于低浸潤(rùn)組，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中比例較高，同時(shí)和生存期相關(guān)，Thota等[15]研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞浸潤(rùn)的III期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后僅次于淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，高浸潤(rùn)組5年生存率顯著低于中、低浸潤(rùn)組。NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞一樣，在腫瘤免疫中發(fā)揮著雙刃劍的作用，通過(guò)激活不同的信號(hào)可以發(fā)揮促腫瘤/抑腫瘤的作用。在腫瘤發(fā)生的初期，NK細(xì)胞作為毒性細(xì)胞可攻擊腫瘤細(xì)胞，清除少量的腫瘤細(xì)胞，而隨著腫瘤的進(jìn)展，NK細(xì)胞受到免疫抑制信號(hào)的影響，發(fā)揮促腫瘤作用，所以NK細(xì)胞在腫瘤中的作用是和腫瘤進(jìn)展有關(guān)的。人源的NK細(xì)胞表達(dá)TIGIT，有研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TIGIT可以明顯抑制NK細(xì)胞對(duì)于過(guò)表達(dá)其配體PVR的靶細(xì)胞殺傷作用[16]，而通過(guò)人外周血來(lái)源的NK細(xì)胞與高表達(dá)PVR的成纖維細(xì)胞系殺傷實(shí)驗(yàn)中用抗體阻斷TIGIT后發(fā)現(xiàn)，TIGIT的抑制效應(yīng)弱于NK細(xì)胞上HLA受體KIR，因?yàn)檎J(rèn)為T(mén)IGIT是NK細(xì)胞共抑制受體，而腫瘤細(xì)胞上一般會(huì)表達(dá)CD155，CD155是TIGIT的競(jìng)爭(zhēng)性配體，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中CD155和NK細(xì)胞上的TIGIT結(jié)合后，可以發(fā)揮免疫抑制作用，降低NK細(xì)胞的殺傷作用，而這種作用和配體表達(dá)水平優(yōu)勢(shì)相關(guān)。另一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)TIGIT通過(guò)其細(xì)胞內(nèi)的免疫受體ITT樣結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷效應(yīng)的抑制功能，TIGIT-PVR作用后，ITT樣結(jié)構(gòu)域通過(guò)225位磷酸化，招募Grb2接頭蛋白，進(jìn)一步結(jié)合SHIP1，終止PI3K和MAPK的信號(hào)，下調(diào)NK細(xì)胞的活性[5, 17]。

腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞表面可以高表達(dá)CD155分子，CD155可以和NK細(xì)胞和T細(xì)胞表面的TIGIT、CD96和CD226等結(jié)合，影響細(xì)胞的免疫功能，CD155是免疫球蛋白超家族的I型跨膜糖蛋白，是NK細(xì)胞活化性受體CD226的配體，而CD226是啟動(dòng)NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要活化性受體之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD155和TIGIT結(jié)合后可以抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤作用，進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)TIGIT/CD155可以促進(jìn) Treg細(xì)胞的免疫抑制作用[18]，增強(qiáng)其IL-10的釋放，這種作用類似于免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1的作用。CD155和CD122同時(shí)也是CD226的配體，與TIGIT可以結(jié)合，CD122是細(xì)胞因子受體亞基，與CD132(γc；IL-2Rγ)結(jié)合形成低親和力IL-2受體；與CD25(IL-2Rα)和CD132結(jié)合形成高親和力IL-2受體；與IL-2結(jié)合促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，分化以及參與外周耐受的調(diào)節(jié)。

結(jié)直腸癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤，已有的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中存在一定程度的免疫抑制，但是其確切的機(jī)制尚未被揭示，通過(guò)本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIGIT及其配體CD155在結(jié)直腸癌組織中存在高表達(dá)，由于TIGIT高表達(dá)于NK細(xì)胞，而CD155的結(jié)合可以抑制NK細(xì)胞的腫瘤殺傷作用，所以認(rèn)為，在結(jié)直腸癌中存在TIGIT/CD155信號(hào)的高表達(dá)，而從臨床數(shù)據(jù)來(lái)看，TIGIT和CD155與腫瘤分期、腫瘤體積以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，隨著分期的增高，TIGIT和CD155的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與腫瘤進(jìn)展存在正相關(guān)；其次，TIGIT和CD155在低分化癌表達(dá)水平高，在淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中表達(dá)水平增高，這暗示TIGIT與分化水平及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此TIGIT/CD155可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道TIGIT/CD155在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制，雖然臨床樣本中發(fā)現(xiàn)TIGIT/CD155在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，但是確切的作用還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TIGIT/CD155在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。