吡咯烷酮類螺環(huán)化合物與β-分泌酶活性中心的結(jié)合機(jī)制

劉中婷,鐘謝斌,王汐璆,莊文昌,朱文友

(徐州工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 徐州 221111)

阿爾茨海默癥(AD)俗稱老年癡呆，進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知能力下降是該病的典型臨床特征，其主要病理特征是存在神經(jīng)纖維纏結(jié)和細(xì)胞外淀粉樣蛋白“斑塊”[1]。斑塊主要由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的蛋白水解片段組成。隨著對(duì)阿爾茨海默癥的不斷深入研究，人們發(fā)現(xiàn)β-分泌酶(BACE)是阿爾茨海默病患者腦中斑塊主要成分淀粉樣蛋白前體蛋白水解片段形成的一種關(guān)鍵酶。AD 的發(fā)生和發(fā)展與大腦中斑塊的沉積有直接關(guān)系，抑制BACE1的水解作用將會(huì)阻斷或減慢斑塊的產(chǎn)生和聚集，從而減緩AD的發(fā)生和發(fā)展，起到干預(yù)治療該疾病的作用[2-4]。抑制BACE1的水解作用已成為阿爾茨海默病患者藥物干預(yù)的主要手段[5]。

早期的BACE抑制劑都是肽類藥物，其作用主要是截取APP斷裂位點(diǎn)附近的片段，通過(guò)加入非天然的氨基酸，來(lái)模擬BACE1與APP作用的過(guò)渡態(tài)異構(gòu)體，從而與APP發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，減少β淀粉樣多肽(Aβ)的產(chǎn)生[6]。雖然肽類抑制劑具有良好的生物相容性，且毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，但是肽類抑制劑相對(duì)分子質(zhì)量較大，生物穩(wěn)定性差，口服利用率低，且不容易通過(guò)血腦屏障[7]。因此，小分子化合物抑制劑成為近年來(lái)研究BACE1抑制劑一大熱點(diǎn)。與之前的肽類抑制劑相比較，它們具有相對(duì)分子質(zhì)量小、生物代謝活性穩(wěn)定、膜通透性好等特點(diǎn)。目前，這些非肽類小分子抑制劑一般是通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的方法完成的，這種方法大大降低了研發(fā)成本，縮短研發(fā)周期[8]。本文主要采用分子對(duì)接方法，利用AutoDock4.2軟件[9]將20種吡咯烷酮類螺環(huán)化合物抑制劑對(duì)接到了BACE1的活性中心。基于分子對(duì)接方法得到的抑制劑在BACE1活性中心的結(jié)合構(gòu)型，分析了影響抑制劑生物活性的主要因素，揭示其與 BACE1 的作用機(jī)制，為抑制劑的設(shè)計(jì)優(yōu)化和結(jié)構(gòu)改造提供了重要參考。

1 計(jì)算方法

1.1 分子對(duì)接

人們已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法得到了BACE1的晶體結(jié)構(gòu)，BACE1晶體結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的PDB編碼為3UDH。我們首先從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了BACE1的晶體結(jié)構(gòu)3UDH。實(shí)驗(yàn)得到的BACE1的晶體結(jié)構(gòu)3UDH的活性中心中含有配體小分子，我們通過(guò)Chimera[10]軟件將配體小分子從蛋白質(zhì)的活性中心剝離。然后使用AutoDock4.2軟件將晶體結(jié)構(gòu)中的水分子刪除，由于實(shí)驗(yàn)得到的晶體結(jié)構(gòu)中并不包含氫原子，在AutoDock4.2軟件中我們對(duì)BACE1的極性基團(tuán)進(jìn)行加氫處理。并在AutoDock4.2軟件中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了電荷計(jì)算。

本文中所有的分子對(duì)接過(guò)程均是在AutoDock4.2軟件中完成的。20個(gè)抑制劑分子與BACE1的分子對(duì)接中，所有的對(duì)接格點(diǎn)間隔均設(shè)為0.375，所構(gòu)建的對(duì)接盒子大小為42×48×54，中心(x,y,z)設(shè)置為20.86，35.66，40.68。所有的分子對(duì)接過(guò)程均采用剛性對(duì)接，即在對(duì)接模擬中BACE1的蛋白結(jié)構(gòu)保持不變。本文中所有對(duì)接均采用拉馬克遺傳算法(LGA)。在RMSD為2.0?下對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行構(gòu)象聚類收集。

1.2 小分子構(gòu)建

為了研究小分子抑制劑與BACE1的結(jié)合機(jī)制，我們基于吡咯烷酮類螺環(huán)化合物構(gòu)建了20個(gè)小分子BACE1抑制劑，如表1所示。我們將構(gòu)建的20個(gè)BACE1抑制劑采用分子對(duì)接方法對(duì)接到了BACE1的活性中心。對(duì)接過(guò)程中，我們考慮了所構(gòu)建的BCAE1抑制劑所有可以自由旋轉(zhuǎn)的共價(jià)鍵，使抑制劑分子在對(duì)接過(guò)程中能夠自由旋轉(zhuǎn)的鍵達(dá)到最大值。

2 結(jié)果

2.1 BACE1活性中心結(jié)構(gòu)

圖1 BACE1及其活性口袋

我們首先使用Chimera軟件對(duì)BACE1的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了，β-分泌酶的活性口袋由Leu30、Asp32、Ser35、Pro70、Tyr71、Thr72、Gln73、Phe108、Trp115、Ile118、Tyr198、Ile226、Asp228、Thr231、Arg235、Val332等殘基構(gòu)成。

2.2 抑制劑與BACE1之間的結(jié)合能

為了考查抑制劑分子與BACE1之間的作用機(jī)制，我們使用Autodock4.2分子對(duì)接模擬軟件，將20種BACE1抑制劑小分子分別對(duì)接到了β-分泌酶的活性中心，得到了20種抑制劑分子與BACE1結(jié)合的結(jié)合能，如表1所示。

表1 抑制劑分子式及與BACE1對(duì)接的結(jié)合能

2.3 抑制劑在BACE1活性中心的結(jié)合構(gòu)象

為了考查抑制劑分子在BACE1結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象，我們將對(duì)接結(jié)果在均方根偏差RMSD為2.0?的條件下進(jìn)行了構(gòu)象聚類分析，將聚類分析得到的構(gòu)象最大簇在BACE1的活性口袋進(jìn)行了構(gòu)象重疊，如圖2所示。此外，為了探究抑制劑分子與BACE1的結(jié)合機(jī)制，我們選取了每組對(duì)接結(jié)果中的一個(gè)典型構(gòu)型進(jìn)行了分析，將每組對(duì)接結(jié)果的典型構(gòu)型在BACE1的活性中心顯示，如圖3所示。

圖2 抑制劑小分子在活動(dòng)中心對(duì)接結(jié)果重疊圖

3 討論

經(jīng)Chimera軟件分析可知，BACE1活性口袋中的Leu30、Pro70、Thr72、Phe108、Trp115、Ile118、Ile226、Thr231、Val332等疏水性殘基構(gòu)成了β-分泌酶活性口袋的疏水通道。

抑制劑分子與BACE1之間的結(jié)合能越大，抑制劑分子越容易與BACE1結(jié)合。由表1可知，抑制劑分子1、3、13、15與BACE1的之間的結(jié)合能較大，它們分別是-10.4、-11.0、-10.0、-10.8 kcal/mol；說(shuō)明這幾個(gè)抑制劑分子能夠很好的與BACE1結(jié)合，具有很好的生物活性；而抑制劑分子11、12與BACE1的結(jié)合能較小，分別為-7.0、-8.2 kcal/mol，說(shuō)明這幾個(gè)抑制劑分子與BACE1的結(jié)合能力較弱。

由圖2可知，20種抑制劑被很好的對(duì)接到了BACE1的活性中心，且得到的對(duì)接結(jié)果都能夠很好的重疊。同時(shí)，BACE1活性口袋中的Leu30、Pro70、Thr72、Phe108、Trp115、Ile118、Ile226、Thr231、Val332等疏水性殘基構(gòu)成的疏水通道很好的將抑制劑分子中的疏水性基團(tuán)包裹。小分子中的疏水性基團(tuán)與活性口袋中的等疏水性殘基形成了疏水作用區(qū)域，使得受體小分子被包裹在疏水口袋中，從而使小分子被很好的對(duì)接到了BACE1的活性口袋中，這種作用有利于構(gòu)象的穩(wěn)定。

圖3 每組最優(yōu)結(jié)果與活性中心對(duì)接構(gòu)象

從圖3中可知，20種抑制劑分子母體吡咯烷酮亞氨基上的H與活性中心Gln73上的羰基之間形成了非常強(qiáng)的氫鍵作用，這是抑制劑能夠抑制BACE1活性的一個(gè)主要因素。此外，抑制劑母體吡咯環(huán)上的亞氨基較容易與Asp32上的羧基形成強(qiáng)的氫鍵作用。當(dāng)抑制劑分子取代基上含有氨基或亞氨基時(shí)，取代基上的氨基或亞氨基也較容易和Asp228上的羧基之間形成氫鍵。抑制劑與BACE1活性中心形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)將抑制劑分子固定在BACE1的活性中心。這與實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論一致[11]。

抑制劑分子與β-分泌酶形成的氫鍵有利于抑制劑小分子與β-分泌酶的結(jié)合，降低抑制劑分子與BACE1結(jié)合的結(jié)合能。由圖3可知，抑制劑分子3除了母體中的吡咯烷酮環(huán)上的亞氨基與Gln73形成氫鍵之外，還有另外兩個(gè)氫鍵生成，分別是吡咯環(huán)上的亞氨基與Asp228生成的氫鍵，以及抑制劑分子取代基上的亞氨基與活性口袋中的Asp228的羰基形成的氫鍵。抑制劑分子3與BACE1之間形成了一個(gè)非常強(qiáng)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使抑制劑分子3較容易與BACE1結(jié)合，這也是抑制劑分子3與BACE1結(jié)合能較低的一個(gè)關(guān)鍵因素。而抑制劑分子12僅僅只有母體吡咯烷酮、吡咯環(huán)上的亞氨基與活性口袋中的Gln73、Asp228形成氫鍵，抑制劑分子12與BACE1之間形成的氫鍵數(shù)量較少，這也是抑制劑分子12與BACE1之間結(jié)合能較高的一個(gè)主要因素。

此外，活性口袋Tyr71側(cè)鏈上的苯基還與抑制劑吡咯烷酮核心結(jié)構(gòu)上的苯基以面對(duì)面相互平行的方式朝向，兩個(gè)苯基之間生成了芳香交互作用，形成了π-π重疊相互作用。π-π堆積作用的形成有利于抑制劑在BACE1活性中心的穩(wěn)定性，增強(qiáng)吡咯烷酮類螺環(huán)化合物抑制劑的生物活性。本文研究結(jié)果與實(shí)驗(yàn)報(bào)道的結(jié)果一致，為以后研究以螺吡咯烷酮核心結(jié)構(gòu)為母體、以β-分泌酶為靶標(biāo)的新型藥物開發(fā)提供了機(jī)理支持及指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本文利用AutoDock4.2程序研究了吡咯烷酮類螺環(huán)化合物抑制劑與BACE1之間的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)抑制劑與活性口袋中的Gln73、Asp228、Asp32之間形成了非常強(qiáng)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。此外，BACE1活性中心Tyr71側(cè)鏈上的苯環(huán)與抑制劑母體中的苯環(huán)形成了π-π堆積作用。π-π堆積作用是吡咯烷酮類螺環(huán)化合物與BACE1之間作用的一個(gè)典型結(jié)構(gòu)特征。