扶正固虛、清熱解毒聯(lián)合療法對小鼠肝癌的治療作用及其機制

李曦，曹楨，劉源

(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，成都 610072)

肝癌是指在肝細胞或肝內(nèi)單管上皮細胞中發(fā)生的惡性腫瘤。根據(jù)中國癌癥中心發(fā)布的研究報告，肝癌發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中居前五位[1]。肝癌的治療方法包括手術切除、肝移植、局部消融治療、介入療法等[2]。接受治療后，很多患者需要堅持使用免疫抑制劑和抗病毒藥物，這些藥物在殺傷病毒的同時對機體免疫功能會造成不良影響。而中醫(yī)認為，肝癌多與正氣虛損、肝郁、瘀血、痰飲、濕熱、熱毒等有關，其基本病機是“正虛邪實”。因此，針對肝癌的治療需要從扶正固虛、清熱解毒、疏肝理氣、活血化瘀等多方面考慮[3]。吳孝雄等[4]也指出，“扶正祛邪”是治療肝癌的基本原則，需根據(jù)患者病情選擇扶正或清熱解毒為主。本研究觀察了觀察扶正固虛、清熱解毒聯(lián)合療法對小鼠肝癌的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級昆明小鼠80只，雌雄各半，平均體質(zhì)量21.22 g，來自成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心。實驗過程中對小鼠的處置符合倫理學規(guī)定。動物飼養(yǎng)環(huán)境安靜整潔，溫濕度適宜(溫度18～24 ℃，相對濕度55%～60%)，光照為12 h光/暗循環(huán)。每天更換墊料，每2天添加1次飼料。

1.2 細胞株及主要試劑 Hca-F肝癌細胞株購自中國醫(yī)學科學院。流式細胞檢測抗體和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自美國R&D公司。

1.3 扶正固虛、清熱解毒藥物制備方法 扶正固虛藥物包括人參15 g、女貞子15 g、山茱萸15 g、白術20 g、黃芪20 g、白芍20 g、陳皮10 g、當歸10 g，清熱解毒藥物包括茵陳30 g、大黃10 g、梔子10 g、黃芩10 g、生地10 g、車前子10 g、柴胡10 g、龍膽草15 g、甘草5 g，將以上藥物浸泡1～2 h，煮沸后文火煎20～30 min，過濾取汁，保存以備后用。

1.4 肝癌模型制備及扶正固虛、清熱解毒藥物給藥方法 將Hca-F肝癌細胞株進行復蘇并培養(yǎng)，將細胞濃度調(diào)整為1×107/mL，之后將培養(yǎng)液注入到5只小鼠的腹腔，每只注射1 mL。接種1周后，使用一次性無菌血液采集裝置刺入小鼠腹腔，抽取腹水，將其稀釋成濃度為10-7個/mL的瘤細胞懸浮液。在65只小鼠的右側(cè)腹股溝皮下接種0.2 mL瘤細胞懸浮液，接種1周后，將皮下瘤體直徑為4～5 mm,造模成功的小鼠篩選出來納入下一步實驗(共49只)。從49只小鼠中選取48只，并將其分為4組各12只，聯(lián)合治療組于第2、4、6、8、10、12天腹腔注射15 mL/kg扶正固虛藥物和15 mL/kg清熱解毒藥物，扶正固虛組于第2、4、6、8、10、12天腹腔注射30 mL/kg扶正固虛藥物，清熱解毒組于2、4、6、8、10、12天腹腔注射30 mL/kg清熱解毒藥物，腫瘤對照組于2、4、6、8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理鹽水，另選取12只健康小鼠(設定為空白對照組)，于2、4、6、8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理鹽水。

1.5 外周血T淋巴細胞亞群及血清細胞因子檢測方法 用0.3%的戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行麻醉，之后眼眶取血2 mL，分裝成2管。①T淋巴細胞亞群：取1 mL血，并分別放入2支EDTA-K2抗凝管中，加入CD4-FITC、CD8-PE熒光標記的抗體，充分混勻，避光靜置。采用FACS Calibur流式細胞儀檢測CD4+T、CD8+T細胞數(shù)量，計算兩者比值(CD4+T/CD8+T)。②細胞因子：另取1 mL血，并以3 000 r/min的速度離心20 min，收集血清，存于-80 ℃環(huán)境保存。采用ELISA法檢測血清IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α，具體操作步驟參考相應試劑盒的說明書。

1.6 腫瘤重量稱量及抑瘤率計算 小鼠眼眶取血后頸椎脫臼處死，摘取腫瘤，稱量給藥后腫瘤重量，同時計算抑瘤率，抑瘤率等于腫瘤對照組瘤重與治療組(設定聯(lián)合治療組、扶正固虛組、清熱解毒組為治療組)瘤重的差值除以腫瘤對照組瘤重。

2 結(jié)果

2.1 各組給藥后腫瘤重量和抑瘤率比較 給藥后腫瘤重量和抑瘤率比較見表1。

表1 各組給藥后腫瘤重量和抑瘤率比較

注：與腫瘤對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合治療組比較，△P<0.05。

2.2 各組給藥后外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比及CD4+T/CD8+T比較 給藥后外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比及CD4+T/CD8+T比較見表2。

表2 各組給藥后外周血CD4+ T細胞、CD8+T細胞百分比及CD4+T/CD8+T比較

注：與腫瘤對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合治療組比較，△P<0.05。

2.3 各組給藥后血清IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平比較 給藥后血清IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平比較見表3。

3 討論

肝癌是一種起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤，患者可出現(xiàn)腹痛、惡心、嘔吐以及發(fā)熱等全身癥狀。目前肝癌的治療是以外科手術切除為主，抗腫瘤藥物治療為輔的續(xù)貫治療，然而免疫調(diào)節(jié)劑等抗腫瘤藥物可抑制骨髓功能，導致粒細胞減少，同時可引起免疫功能降低，誘發(fā)感染等并發(fā)癥，極大降低了抗腫瘤效果。中醫(yī)認為，肝癌是由于氣滯、血瘀、濕濁、痰凝、濕熱、熱毒等因素膠合，機體內(nèi)生癌毒，凝滯氣血津液，肝膽惡肉生成所致，據(jù)此認為肝癌治療的關鍵是去除相關病理因素，消除癌毒[5]。

表3 各組給藥后血清IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平比較

注：與腫瘤對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合治療組比較，△P<0.05。

扶正固虛是腫瘤治療的基礎，其關鍵在于調(diào)整人體的機能狀態(tài)，調(diào)動內(nèi)在的抗病機能，為緩解病情或抑制腫瘤創(chuàng)造有利條件[6]。以往研究[7～12]表明，扶正固虛在治療包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中效果很好，能縮小腫瘤體積、減少腫瘤生成、改善患者癥狀、延緩腫瘤的進展時間、延長生存期、明顯提升患者生存質(zhì)量。由于肝癌邪毒積聚、郁久易化熱，清熱解毒也成為其常用的治療手段。賀天臨等[13]發(fā)現(xiàn)，清熱解毒方配合TACE治療中晚期肝癌能減輕患者疲倦和常見的消化道不良反應，顯著提升患者的生存質(zhì)量，提高6個月與1年的生存率。動物實驗也證實，清熱解毒中藥單體對SMMC-7721肝癌細胞增殖和H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用[14]，但綜合分析兩者聯(lián)合作用的研究較少。本研究表明，與腫瘤對照組比較，各治療組腫瘤重量明顯更低，且聯(lián)合組小鼠的腫瘤重量明顯低于扶正固虛組和清熱解毒組。抑瘤率方面，聯(lián)合治療組的抑瘤率達到56.76%，明顯高于其他治療組，提示聯(lián)合療法可明顯抑制腫瘤生長。

腫瘤浸潤淋巴細胞包括CD4+T細胞亞群和CD8+特異性T細胞亞群，前者也稱作輔助性T淋巴細胞，在清除外侵病原體的免疫反應中發(fā)揮重要作用，而后者具有細胞殺傷毒性，兩者相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮抗腫瘤作用[15]，兩者比值也可反映機體的免疫功能。IL-2和IL-6能促進T細胞增殖，參與抗體反應、機體造血和腫瘤監(jiān)視。TNF-α和IFN-γ則具有較強的抗腫瘤作用，在癌癥治療中發(fā)揮重要作用。本研究表明，與腫瘤對照組比較，其余治療組的CD4+T和CD8+T細胞數(shù)量，CD4+/CD8+比例及細胞因子水平有所增加，且與單獨治療組比較，聯(lián)合治療組明顯更高，提示治療后機體免疫功能明顯增強，且聯(lián)合治療效果更明顯，與以往研究[16～18]結(jié)果類似。張桂瓊等[19]認為，扶正升血顆粒能增加荷H22瘤小鼠免疫器官(胸腺和脾臟)的重量，通過增強淋巴細胞的增殖活性，促進腫瘤小鼠白介素2的分泌，從而增強荷瘤小鼠的免疫功能。一項針對110例晚期原發(fā)性肝癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，健脾扶正湯治療肝癌效果顯著，能提高CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值，明顯降低中醫(yī)證候積分，改善肝功能和免疫功能，提高患者的生活質(zhì)量[20]。

總之，扶正固虛、清熱解毒聯(lián)合療法可調(diào)節(jié)腫瘤小鼠T淋巴細胞亞群平衡，表現(xiàn)為CD4+T細胞和CD8+T數(shù)量明顯升高，比值升高，多種細胞因子分泌增多，使免疫功能恢復到正常狀態(tài)，甚至高于對照組，提示扶正固虛和清熱解毒聯(lián)合療法具有抑制腫瘤進展和改善免疫功能的作用，未來值得在臨床推廣。