Bax、Bad基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞后的翻譯水平觀察

王孜恒，周敬偉，侯筱宇

(1徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州 221000；2江蘇省腦病生物信息重點實驗室)

凋亡最早是由英國病理學(xué)家Kerr JF教授于1972年根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變提出的概念，是指細(xì)胞在接受外界信號刺激后啟動的主動的程序性細(xì)胞死亡過程[1]。在人體內(nèi)每天約有1×109個細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]。細(xì)胞凋亡涉及內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑，內(nèi)外途徑協(xié)同工作，清除體內(nèi)有缺陷的細(xì)胞，使機(jī)體保持健康，而不受控制的細(xì)胞增殖會導(dǎo)致癌癥[3]等疾病的發(fā)生發(fā)展。重大腦疾病如缺血性腦血管病[4,5]、阿爾茨海默病[6]、帕金森病[7]等均與選擇性的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。深入研究選擇性神經(jīng)元凋亡的信號傳遞及調(diào)控有助于發(fā)現(xiàn)潛在的治療藥物靶點。研究表明，Bcl-2家族蛋白可促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡，取決于它們的表達(dá)譜、定位或構(gòu)象。Bax是首個發(fā)現(xiàn)的能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，也是目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡中最為關(guān)鍵的分子[8]，其編碼的蛋白質(zhì)由192個氨基酸組成，分子量為20 kD[9]。凋亡應(yīng)激時，Bax從胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移并形成寡聚體錨定在線粒體外膜上介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。Bad是只含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，由204個氨基酸組成，分子量為23 kD[11]。Bad能夠促使Bax釋放并向線粒體轉(zhuǎn)移，其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用同樣不可忽視。但是Bax和Bad在選擇性神經(jīng)元凋亡過程中的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。本研究通過構(gòu)建Bax、Bad基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Bax和pcDNA3.1-Bad，并觀察Bax、Bad在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步研究腦疾病發(fā)生發(fā)展中Bax和Bad的亞細(xì)胞分布、線粒體轉(zhuǎn)位及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 真核表達(dá)載體、菌株和細(xì)胞株 真核表達(dá)載體pcDNA3.1為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購買于博邁德生物，人胚腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent購自Ambion公司;PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、QuickCutTMEcoR I、QuickCutTMKpn I、QuickCutTMXho I、T4 DNA Ligase及DNA Marker購自Takara公司；LB AGAR及LB BROTH BASE購自Invitrogen公司；SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒及SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自Sango Biotech公司；Agarose購自SunShineBio公司；PureLinkTMHiPure Plasmid Midiprep Kit購自Thermo Fisher公司；PEI購自Sigma公司；兔源Bax單克隆抗體、兔源Bad單克隆抗體及鼠源β-actin多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 Bax、Bad真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad)的構(gòu)建 ①引物設(shè)計與合成：采用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的DNA序列數(shù)據(jù)庫查找Bax以及Bad的cDNA序列，根據(jù)其序列和pcDNA3.1載體上的多克隆位點，依據(jù)引物設(shè)計的一般原則，使用Primer Premier 5引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，并加上合適的限制性內(nèi)切酶位點。引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：Bax上游引物序列為5’-CGGAATTCCACGTCTGCGGGGAGTCACGTG-3’，酶切位點EcoRⅠ，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGAAGGCAGCAGGAAGCCTCAGCC-3’，酶切位點XhoⅠ；Bad上游引物序列為5’-GGGGTACCATGGGAACCCCAAAGCAGCCCT-3’，酶切位點KpnⅠ，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGGGGCGA-TGGGAGCGGGTAGAAT-3’，酶切位點XhoⅠ。②目的基因的擴(kuò)增：采用雄性健康SD大鼠腦組織為材料，使用RNA抽提試劑盒提取大鼠腦組織總RNA。使用目的基因特異性上下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。③真核表達(dá)載體的構(gòu)建：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行膠回收，回收純化產(chǎn)物使用特異性限制內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后連接至pcDNA3.1表達(dá)載體，篩選陽性真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切電泳鑒定。取10 μL質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序驗證。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞后Bax、Bad表達(dá)觀察 ①HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)和pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad轉(zhuǎn)染：HEK293細(xì)胞在37 ℃含5%CO2的溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基。將真核表達(dá)質(zhì)粒和脂質(zhì)體分別稀釋于適量培養(yǎng)基中，靜置5 min后將真核表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體均勻混合，室溫放置20 min，等待時將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，20 min后將真核表達(dá)質(zhì)粒脂質(zhì)體混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，4 h后更換含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞。②免疫印跡分析：將細(xì)胞超聲破碎后按改良Lowry法測定細(xì)胞蛋白總量，取相同蛋白量的細(xì)胞樣品經(jīng)15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜置于封閉液(3%BSA)中室溫孵育3 h，一抗工作液(Bax為1∶1 000；Bad為1∶10 000)中4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液洗膜5 min×3次，加入二抗工作液(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗滌緩沖液洗膜5 min×6次，曝光，掃描膜上顯色條帶。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增出的cDNA序列大小和Bax(680 bp)、Bad(660 bp)基因片段大小一致，見圖1；培養(yǎng)的單菌落提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切電泳鑒定，酶切產(chǎn)物和目的基因大小一致，見圖2；南京金斯瑞生物科技有限公司測序結(jié)果與NCBI的DNA序列數(shù)據(jù)庫中Bax、Bad的cDNA序列完全一致。上述結(jié)果表明pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：A:Bax 680 bp；B：Bad 660 bp。

注：A:pcDNA3.1-Bax；B：pcDNA3.1-Bad。

2.2 HEK293細(xì)胞中Bax、Bad表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Bax真核表達(dá)質(zhì)粒組在相對分子質(zhì)量約20 kD處檢測到Bax過表達(dá)條帶，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Bad真核表達(dá)質(zhì)粒組在相對分子質(zhì)量約23 kD處檢測到Bad過表達(dá)條帶(Bad上方條帶可能為其修飾條帶)，見圖3。結(jié)果表明pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中成功過表達(dá)。

注：A:Bax;B:Bad。

3 討論

目前認(rèn)為在細(xì)胞凋亡中Bax是最為重要的分子，在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。在正常生理狀態(tài)下，Bax在胞質(zhì)和線粒體外膜上動態(tài)轉(zhuǎn)移，處于平衡狀態(tài)[12]，而在應(yīng)激條件下，Bax從胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移后并不能再次回到胞質(zhì)，而是錨定在線粒體外膜形成寡聚體，介導(dǎo)凋亡的發(fā)生發(fā)展[13]。Bax是首個發(fā)現(xiàn)能夠和Bcl-2蛋白直接相互作用的蛋白，兩者之間能夠形成異源二聚體進(jìn)而起到共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用[14]。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白能夠和Bax蛋白結(jié)合，將Bax穩(wěn)定在胞質(zhì)中，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)細(xì)胞遭遇外界或者內(nèi)部應(yīng)激時，Bax在Bad等促凋亡蛋白作用下，和Bcl-2或其他抗凋亡蛋白解離，Bax向線粒體轉(zhuǎn)移并錨定在線粒體外膜上，進(jìn)而形成寡聚體促使線粒體通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而啟動凋亡程序[15]。因此有研究認(rèn)為Bcl-2和Bax之間的動態(tài)平衡對細(xì)胞的存活尤其重要。Bad能夠發(fā)揮促凋亡作用主要依賴于促凋亡蛋白最重要的功能區(qū)即BH3結(jié)構(gòu)域，目前所報道的包含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白均為促凋亡蛋白家族成員，并且都可以通過和凋亡抑制蛋白相互作用進(jìn)而發(fā)揮促凋亡功能[16]。目前是否存在Bcl-2家族以外的蛋白調(diào)節(jié)Bax在胞質(zhì)和線粒體之間的轉(zhuǎn)移進(jìn)而調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑我們不得而知，在這個過程中Bad又扮演著怎樣的角色還尚不清楚，均有待于進(jìn)一步探究。

缺血性腦卒中是多因素、多細(xì)胞介導(dǎo)的病理損傷過程，其損傷機(jī)制非常復(fù)雜，迄今為止醫(yī)學(xué)上仍無法完全闡明[17]。目前國際上對于缺血性腦卒中公認(rèn)的治療方案是盡早恢復(fù)或重建血流再灌注[18]，但再灌注會使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生快速的級聯(lián)損傷反應(yīng)，從而進(jìn)一步加重缺血組織的病理損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞自身凋亡。腦缺血再灌注后會誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化，其中促凋亡蛋白以及抗凋亡蛋白的改變對細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展尤為重要，而在這其中Bcl-2家族蛋白發(fā)揮重要作用[19]。在機(jī)體正常生理狀態(tài)下，Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白都處于細(xì)胞中某一固定的位置中。一般來說，抗凋亡蛋白主要是膜內(nèi)蛋白，可以靶定在線粒體膜、細(xì)胞核膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上；促凋亡蛋白一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)松散的黏附在線粒體表面。在凋亡刺激信號作用下，BH3結(jié)構(gòu)域亞家族蛋白如Bad、tBid能與Bcl-2樣抗凋亡亞家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xl形成的凹槽結(jié)合，置換出促凋亡蛋白Bax/Bak，后者轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，促使線粒體膜通透性增強(qiáng)，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[20]。目前有關(guān)腦缺血再灌注后線粒體凋亡途徑的研究主要以Bax為核心[21]，但目前關(guān)于其他家族蛋白對Bax所介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑影響的研究還很少，關(guān)于其在腦缺血再灌注損傷中的機(jī)制研究更是寥寥無幾，仍需進(jìn)一步深入探究。

在本研究中，我們從大鼠腦組織中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到Bax以及Bad的cDNA序列，使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后與pcDNA3.1載體進(jìn)行連接，酶切結(jié)果表明Bax和Bad基因序列成功插入到pcDNA3.1載體中，DNA測序及比對結(jié)果確定真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Bax和pcDNA3.1-Bad中的插入片段和目的基因的CDS區(qū)序列完全一致，表明真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，蛋白免疫印跡證實真核表達(dá)質(zhì)粒在真核細(xì)胞中成功過表達(dá)。Bax以及Bad真核細(xì)胞真核表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建為研究Bax和Bad的亞細(xì)胞分布、線粒體轉(zhuǎn)位及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。對Bax以及Bad進(jìn)行深入研究不僅對細(xì)胞凋亡機(jī)制的闡明有重要作用，對腦疾病的靶向治療也有重要意義。