躍變型果實(shí)貯藏淀粉降解研究進(jìn)展

蕭允藝，姚祥濱，劉杰鳳，李 穎

（1.廣東石油化工學(xué)院廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心/廣東普通高校食品科學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，廣東 茂名 525000；2.廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 茂名 525000）

淀粉是果實(shí)重要的貯藏碳水化合物，由直鏈淀粉（10%～25%）和支鏈淀粉（75%～90%）兩類葡萄糖聚合物組成[1-2]。前者為由葡萄糖殘基以α -1,4-糖苷鍵首尾聚合而成的無分支的直鏈分子，后者則是葡萄糖殘基以α-1,4-糖苷鍵及α-1,6-糖苷鍵聚合而成的帶分支長(zhǎng)鏈。非晶體結(jié)構(gòu)的直鏈淀粉和支鏈淀粉相互作用形成的晶體結(jié)構(gòu)最終形成不溶于水的半晶體顆粒，即淀粉粒[3-4]。淀粉按功能可分為暫時(shí)淀粉和貯藏淀粉，暫時(shí)淀粉分布在葉片等“源”組織中，白天光合作用形成暫時(shí)淀粉，晚上暫時(shí)淀粉降解，為葉片呼吸作用和進(jìn)一步的蔗糖合成提供底物并轉(zhuǎn)移到植物的“庫(kù)”[5-6]。

貯藏淀粉分布在果實(shí)、種子、塊根、塊莖、鱗莖等非光合作用細(xì)胞質(zhì)體（造粉體）中，用于中期或長(zhǎng)期貯藏，當(dāng)植物需要時(shí)，會(huì)重新降解利用，如谷物類種子萌發(fā)所需的能量主要由貯藏的淀粉水解獲得[7-9]。某些躍變型果實(shí)在成熟前含有大量的貯藏淀粉，如香蕉[10]、獼猴桃[11-12]、芒果[13]、鱷梨[14]等，在采后成熟過程中淀粉降解作為果實(shí)提供呼吸代謝的底物并形成風(fēng)味影響果實(shí)的食用品質(zhì)。

淀粉降解的主要產(chǎn)物為麥芽糖和葡萄糖，它們都可以被運(yùn)送至質(zhì)體外為細(xì)胞代謝利用[15]。淀粉的降解為非光合器官維持持續(xù)的碳水化合物供應(yīng)，對(duì)于植物正常生長(zhǎng)和適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境至關(guān)重要[2]。果實(shí)淀粉降解對(duì)于果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)形成，尤其是呼吸躍變型果實(shí)，在采后成熟過程中，淀粉含量會(huì)隨著呼吸躍變急劇下降[10]。為此，我們近年來幾種高貯藏淀粉的躍變型果實(shí)淀粉降解的研究進(jìn)展，概括其淀粉降解參與的酶基因及其存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以期了解果實(shí)貯藏淀粉降解的特點(diǎn)，為今后果實(shí)淀粉降解基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)和研究方向。

1 植物暫時(shí)淀粉降解

在模式植物擬南芥葉片淀粉降解研究表明，葉片暫時(shí)淀粉降解由多種酶蛋白共同參與完成（圖1）[16]，這些酶基因缺失或沉默都會(huì)導(dǎo)致淀粉過量表型，主要包括：葡聚糖水合雙激酶（Glucan water dikinase，GWD）[17]、磷酸化葡聚糖水合雙激酶（Phosphoglucan water dikinase，PWD）[18]、雙特異性磷酸酶（Dualspecificity phosphate,DSP4，又名Starch excess 4，SEX4）[19]、磷酸化酶LSF1/2 (Like SEX Four 1/2)[20]、α-淀粉酶（α-amylase，AMY）[21]、β-淀粉酶（β-amylase，BAM）[22-23]、異淀粉酶（isoamylase，ISA）[24]、極限糊精酶（Limit dextrinase，LDA）、α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase，PHS）[25]、4-α葡聚糖轉(zhuǎn)移歧化酶（4-α-glucanotransferase Disproportionating enzyme，DPE）[26-27]、麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Maltose transporter，MEX）[28]及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Glucose transporter，pGlcT）[29]以及淀粉粒相關(guān)功能蛋白早期饑餓蛋白（early starvation1，ESV1）和類早期饑餓蛋白（Like Early Starvation1，LESV）[30]等。擬南芥葉片淀粉降解的基礎(chǔ)研究為其他模式植物以及果實(shí)貯藏淀粉降解提供充足的參考價(jià)值。

圖1 擬南芥葉片淀粉降解示意圖Fig.1 Sketch map of starch degradation in Arabidopsis leaves

2 貯藏淀粉降解研究

果實(shí)是植物貯藏淀粉的重要器官之一，如未成熟的香蕉、獼猴桃、蘋果等躍變型果實(shí)中都含有大量淀粉[12,31-32]。淀粉在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期慢慢積累并在成熟過程中降解為可溶性糖，使果實(shí)甜度上升。目前報(bào)道參與果實(shí)淀粉降解的酶基因只在番茄、獼猴桃、蘋果和香蕉等水果中少數(shù)報(bào)道（表1），但相關(guān)的遺傳規(guī)律和調(diào)控機(jī)制尚無深入研究。

表1 躍變型果實(shí)淀粉降解相關(guān)基因匯總Table 1 Summary of genes related to starch degradation in climacteric fruits

2.1 番茄果實(shí)淀粉降解

在番茄果實(shí)發(fā)育過程中，淀粉含量達(dá)到最大值后，淀粉開始水解，淀粉合成速度低于降解速度，當(dāng)果實(shí)到達(dá)著色期（Color break）時(shí)，淀粉基本完全降解[33]。然而早期早番茄果實(shí)淀粉降解的相關(guān)研究未受到關(guān)注，在花粉淀粉降解的研究則有所進(jìn)展，利用轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)突變表達(dá)番茄LeGWD基因（legwd:Ds），使得番茄雄性不育，突變后的番茄花粉顯示出sex表型，抑制了花粉萌發(fā)，研究結(jié)果說明葡聚糖磷酸化酶參與花粉淀粉的降解過程[34]。后來果實(shí)淀粉降解的相關(guān)研究才開始被重視，MARIA等[35]發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶活性隨著番茄成熟淀粉降解及可溶性糖含量上升而提高，推測(cè)3個(gè)β-淀粉酶基因（bAmy1/2/3）參與淀粉的水解。最新研究發(fā)現(xiàn)，SlWHY1蛋白通過調(diào)節(jié)淀粉降解，增強(qiáng)番茄植株耐冷性但未見影響番茄果實(shí)淀粉降解報(bào)道[36]。而香蕉轉(zhuǎn)錄因子MaMYB3在Micro-Tom小番茄過表達(dá)結(jié)果顯示，番茄果實(shí)中淀粉降解相關(guān)基因SlGWD1、SlPWD1、SlLSF2、SlBAM1,SlAMY3和 SlAMY4表達(dá)下調(diào)，淀粉降解受阻延緩果實(shí)成熟[32]?？偠灾?，番茄果實(shí)淀粉降解關(guān)鍵酶基因的挖掘及功能驗(yàn)證研究欠缺，還需進(jìn)一步篩選驗(yàn)證。

2.2 蘋果果實(shí)淀粉降解

研究發(fā)現(xiàn)，在蘋果果實(shí)發(fā)育過程中，β-淀粉酶和α-淀粉酶活性活性變化與淀粉含量大致呈現(xiàn)互為消長(zhǎng)的趨勢(shì)，推測(cè)它們參與了果實(shí)質(zhì)體中淀粉的降解過程[37-38]。而果實(shí)淀粉降解受到乙烯抑制劑1-MCP顯著抑制，嘎拉蘋果果實(shí)軟化的初始階段，淀粉降解對(duì)果實(shí)軟化的影響最顯著，并伴隨淀粉酶(AM)活性和MdAM基因表達(dá)的快速上升，且淀粉含量、AM活性及它們與硬度的相關(guān)性均顯著受到低溫和乙烯因子的調(diào)節(jié)，表明淀粉降解與嘎拉蘋果果實(shí)軟化關(guān)系密切[39]。DOERFLINGER等[40]以兩個(gè)蘋果品種（McIntosh、Empire）為試材，在果實(shí)采收前1周處理1-MCP或2、4周前分別處理AVG，發(fā)現(xiàn)Empire果實(shí)采后貯藏過程中淀粉降解延遲，但不能阻止淀粉的最終降解。蘋果作為我國(guó)北方主產(chǎn)水果之一，控制貯藏條件，果實(shí)可以進(jìn)行將近一年時(shí)間的貯藏，貯藏過程中淀粉的降解與其耐貯性關(guān)系還需更多證據(jù)。

2.3 獼猴桃果實(shí)淀粉降解

獼猴桃果實(shí)采后成熟過程中淀粉降解，并伴隨著可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）含量上升[41-42]。采收后的果實(shí)淀粉含量在室溫下隨時(shí)間延續(xù)而下降，乙烯加劇淀粉的降解，而低溫能有效延緩貯藏過程中淀粉水解酶活性上升從而有效緩解淀粉降解。研究發(fā)現(xiàn)，有24個(gè)基因與獼猴桃（Actinidia deliciosa）淀粉降解相關(guān)，其中AdAMY1，AdAGL3和AdBAM3.1/3L/9受乙烯誘導(dǎo)與淀粉降解正相關(guān)并受氣調(diào)貯藏抑制，推測(cè)這5個(gè)基因參與獼猴桃采后成熟過程中淀粉的降解[42]。陳景丹等[43]研究發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，紅陽(yáng)獼猴桃（Actinidia chinensis）采后淀粉降解與果實(shí)軟化密切相關(guān)，乙烯能通過調(diào)節(jié)AcPWD、AcAMY1、AcAMY3、AcBAM1和AcABAM3的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)淀粉降解和果實(shí)軟化，而外源1-MCP作用相反。最新研究發(fā)現(xiàn)在獼猴桃葉片中穩(wěn)定過表達(dá)AdBAM3L能有效降低葉片淀粉含量，說明其是獼猴桃淀粉降解的關(guān)鍵酶基因，另外，轉(zhuǎn)錄因子AdDof3通過結(jié)合AdBAM3L的啟動(dòng)子并激活表達(dá)，從而參與果實(shí)淀粉降解的調(diào)控[11]。獼猴桃果實(shí)淀粉的降解與果內(nèi)軟化密切相關(guān)，不但在關(guān)鍵酶基因篩選上進(jìn)行了探究，還在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，豐富了果實(shí)淀粉降解的網(wǎng)絡(luò)，為其他果實(shí)淀粉降解研究提供參考。

2.4 香蕉果實(shí)淀粉降解

香蕉果實(shí)發(fā)育過程中，淀粉慢慢積累起來，可達(dá)到干重的60%～90%[44-45]，采后成熟過程中迅速降解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，淀粉含量從呼吸躍變前的22%鮮重降到躍變后的1%鮮重[46]。果肉淀粉降解是果實(shí)硬度下降的一個(gè)重要因素，因?yàn)榈矸鄄坏鳛榧?xì)胞的主要貯藏物，還是呼吸能量源，為細(xì)胞呼吸躍變及乙烯誘發(fā)的高速細(xì)胞壁代謝提供前提條件，最終果實(shí)衰老軟化。香蕉果肉淀粉降解的早期研究主要是發(fā)現(xiàn)與淀粉降解相關(guān)的酶基因：α-淀粉酶基因MAmy[47]，淀粉去分支酶基因Maisa[48]和β-淀粉酶基因Mabmy[49]。近年研究表明β-淀粉酶在大蕉和巴西蕉果實(shí)淀粉降解中起關(guān)鍵作用[50]。另外最新轉(zhuǎn)錄水平和蛋白組研究發(fā)現(xiàn)，香蕉參與果肉淀粉降解的38酶基因，并有27個(gè)酶基因受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MabHLH6能結(jié)合并激活 MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2，MaISA3和MapGlcT2-2等11個(gè)淀粉降解相關(guān)基因的啟動(dòng)子，是響應(yīng)果實(shí)成熟淀粉降解起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄激活子[10]。后續(xù)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，一個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子MaMYB3可以靶定MabHLH6和10個(gè)淀粉降解相關(guān)酶基因的啟動(dòng)子，并抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在番茄中超表達(dá)MaMYB3，發(fā)現(xiàn)番茄果實(shí)中淀粉降解相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，淀粉降解受阻延緩果實(shí)成熟，揭示了MaMYB3通過直接抑制淀粉降解相關(guān)基因和MabHLH6，參與調(diào)控果實(shí)成熟[32]，豐富了香蕉降解的網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

圖2 香蕉淀粉降解調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Degradation regulation network of banana starch

3 果實(shí)淀粉降解研究展望

在人們生活水平不斷改善的今天，水果糖含量備受農(nóng)業(yè)和消費(fèi)者關(guān)注，因此關(guān)于各種果實(shí)在發(fā)育成熟和采后衰老過程中淀粉的降解調(diào)控作用機(jī)理是目前研究的熱點(diǎn)。果實(shí)成長(zhǎng)發(fā)育至采后成熟是一個(gè)動(dòng)態(tài)的生命活動(dòng)過程，前階段果實(shí)主要是果實(shí)淀粉積累，后階段以果實(shí)淀粉降解為主。果實(shí)淀粉降解由一系列酶基因參與完成，同時(shí)受果實(shí)成熟相關(guān)眾多影響因素在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。果實(shí)淀粉降解研究雖然起步較晚，但是依靠目前成熟的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白組測(cè)序、代謝組質(zhì)譜分析和基因定點(diǎn)敲除等研究手段，未來十年，果實(shí)淀粉降解研究將迎來重大發(fā)展和突破。

3.1 果實(shí)淀粉降解研究的不足之處

作為果實(shí)研究的模式植物，番茄果實(shí)淀粉的降解研究存在較大空白，涉及果實(shí)淀粉降解的酶基因還未被完全挖掘。香蕉和獼猴桃作為高淀粉水果，淀粉降解的研究在近幾年才有所突破，不過目前還未涉及遺傳規(guī)律研究。果實(shí)淀粉降解的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及多種轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平以及翻譯后水平的多層次、多階段的協(xié)同作用（圖3）。因此目前研究某個(gè)或少數(shù)幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控淀粉降解仍不足以闡明果實(shí)淀粉降解的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖3 多層次果實(shí)常數(shù)降解研究思路Fig.3 Research idea of mutti-level degradation of fruit starch

3.2 果實(shí)淀粉降解與非果實(shí)淀粉降解的異同

非果實(shí)淀粉主要包括葉片暫時(shí)淀粉和組織貯藏淀粉兩種存在形式。葉片暫時(shí)淀粉是葉片通過光合作用在葉綠體中合成臨時(shí)儲(chǔ)備碳源，并可通過降解為葡萄糖和麥芽糖長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)街参锲渌课?。而組織貯藏淀粉多貯藏于塊莖或塊根細(xì)胞淀粉體和種子胚乳中，作為組織器官的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以備生長(zhǎng)所需，如塊莖和種子萌芽。如馬鈴薯淀粉體中的淀粉降解主要發(fā)生在以下兩種情況：一種是馬鈴薯低溫貯藏過程中淀粉降解糖化，導(dǎo)致還原糖積累。另外是貯藏淀粉降解為塊莖發(fā)芽提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[54]。淀粉降解主要通過淀粉磷酸化途徑和淀粉水解，其過程包括可溶性葡聚糖的釋放、可溶性和線性葡聚糖的降解和麥芽糖代謝3個(gè)階段。目前研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯α-淀粉酶活性主要由StAmy23引起，β-淀粉酶活性主要由StBAM1和tBAM7引起，冷藏塊莖中的淀粉酶抑制劑可以調(diào)節(jié)淀粉酶的活性[55]。

果實(shí)淀粉降解與葉片暫時(shí)淀粉降解具有更多相似之處，淀粉降解相關(guān)的酶在淀粉貯藏細(xì)胞中合成，參與淀粉降解相關(guān)的酶種類相似，但是葉片淀粉降解受光照調(diào)控啟動(dòng)，而果實(shí)淀粉降解不受光照影響，而受一系列激素（尤其是乙烯）誘導(dǎo)調(diào)控。另外，谷物種子胚乳是死細(xì)胞組織，降解淀粉所需的酶由盾片或者糊粉層（包圍在胚乳表面的一層活細(xì)胞）合成并釋放到胚乳中，又或者是β-淀粉酶在種子發(fā)育時(shí)就形成貯藏在胚乳中，后經(jīng)種子萌發(fā)時(shí)被活化起作用。然而目前研究發(fā)現(xiàn)，只有三種淀粉降解相關(guān)的酶參與胚乳淀粉的降解，分別是：α-淀粉酶[56]、β-淀粉酶[57]、DBE（極限糊精酶，LD）[58]。雖然 GWD 和PWD都存在于谷類種子中，種子貯藏淀粉粒上只檢測(cè)到非常低水平的共價(jià)連接的磷酸鹽，也沒有足夠的ATP去維持循環(huán)的磷酸化作用[59]。因此，谷類淀粉降解與葉綠體暫時(shí)淀粉和果實(shí)貯藏淀粉的降解的機(jī)理有明顯不同。

3.3 果實(shí)淀粉降解的調(diào)控研究思路

轉(zhuǎn)錄因子參與果實(shí)發(fā)育成熟的研究越來越受到關(guān)注，此類核小蛋白在果實(shí)成熟發(fā)育過程中起到杠桿效果[60]。在線轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（PlantTFDB 4.0[61]和iTAK[62]）并結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果，可以讓研究者獲得大量的與果實(shí)降解同步表達(dá)差異轉(zhuǎn)錄因子，為后期闡明果實(shí)淀粉降解的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供最基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。

隨著蛋白組測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，翻譯后水平的蛋白修飾調(diào)控也備受研究者青睞，如蛋白泛素化測(cè)序、組蛋白乙酰化測(cè)序、蛋白磷酸化測(cè)序等。蛋白質(zhì)泛素化是體內(nèi)具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，體內(nèi)泛素化和去泛素化的動(dòng)態(tài)平衡，是調(diào)控蛋白質(zhì)降解和維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制，對(duì)蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用[63]。蛋白質(zhì)磷酸化是一種非常重要且廣泛存在的翻譯后修飾調(diào)控方式，參與細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡，細(xì)胞骨架調(diào)控、新陳代謝等，對(duì)許多生物的細(xì)胞功能起著生物“開/關(guān)”作用[64]。蛋白質(zhì)乙?；瘏⑴c了幾乎所有的生物學(xué)過程，如轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝以及蛋白合成與降解等，除了對(duì)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活外，對(duì)蛋白質(zhì)的功能也產(chǎn)生很大影響，包括酶的活化與失活、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位和特殊功能復(fù)合體的形成等[65]。

同時(shí)，通過質(zhì)譜分析，不但可以知道蛋白是否發(fā)生修飾，而且可以確定修飾的位點(diǎn)及程度。為果實(shí)淀粉降解參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白的深入研究提供平臺(tái)支持。

另外，定點(diǎn)突變技術(shù)CRISPR自2014在番茄中便開啟應(yīng)用，此后，CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于柑橘、黃瓜、蘋果、葡萄、西瓜、獼猴桃、香蕉等作物[66]。此技術(shù)的推廣將為果實(shí)淀粉降解的研究提供強(qiáng)大的科研工具，將大大促進(jìn)構(gòu)建完善的果實(shí)淀粉降解的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子或者蛋白修飾調(diào)控組分?？偠灾芯抗麑?shí)淀粉降解，將豐富果實(shí)采前和采后生物學(xué)的理論，有助于利用基因工程或者其他手段改進(jìn)果實(shí)的保鮮技術(shù)。