加味補陽還五湯在大鼠視神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用研究△

李宏松 龍?zhí)?吳惠琴 杜蕊 陸慧琴 趙雋

外傷性視神經(jīng)損傷是一種嚴重危害視功能的眼外傷疾病，常與顱腦外傷并發(fā)，占頭部閉合性損傷的0.5%～5.0%[1]。目前，該病的具體發(fā)病機制尚未完全明確，因此仍缺乏較好的治療方法，預(yù)后不佳。近年研究表明，補陽還五湯具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)、益精明目之功效，在外周神經(jīng)損傷的動物實驗及臨床應(yīng)用中取得較好的療效[2-4]。本實驗擬建立外傷性視神經(jīng)損傷的大鼠模型，探討加味補陽還五湯在視神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取健康SD雄性大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g。眼科常規(guī)檢查未見明顯疾病。由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供并進行常規(guī)飼養(yǎng)。實驗動物及實驗條件的配置符合《實驗動物管理條例》。本研究方案通過西安市第一醫(yī)院倫理委員會的審查并批準實施。

1.1.2 主要試劑和儀器加味補陽還五湯組方：生黃芪3 g、當歸 3 g、赤芍 2 g、地龍3 g、川芎 2 g、紅花2 g、桃仁 0.5 g、丹參3 g(西安市第一醫(yī)院制劑室制備；生藥濃度約為 1 g·mL-1溶液，無菌罐封后置入 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。TUNEL染色試劑盒(美國PROMEGA公司)；SP系列試劑盒(美國ZYMED公司)；手術(shù)顯微鏡(日本拓普康)；眼科顯微手術(shù)器械(中國蘇州醫(yī)療器械廠)；眼科電生理檢測儀(德國羅蘭公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組隨機將大鼠分為藥物組、生理鹽水組及空白對照組，每組10只，藥物組及生理鹽水組制作動物模型，并于造模后每日固定時間灌胃加味補陽還五湯和生理鹽水，每天2次，藥物組每日總劑量10 g·kg-1[5]；空白對照組不做處理。

1.2.2 動物模型制作均以右眼為實驗眼。參照文獻建立單眼視神經(jīng)損傷模型[6-7]，具體步驟：大鼠以100 g·L-1水合氯醛注射液(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后側(cè)臥于顯微鏡下，從外眥部球結(jié)膜與穹隆結(jié)膜交界處剪開結(jié)膜及鞏膜約1/4 象限，鈍性分離筋膜組織至暴露視神經(jīng)，輕輕剝開視神經(jīng)表面鞘膜，在球后約2 mm的位置使用50 g力的反向夾持鑷垂直于視神經(jīng)長軸夾持視神經(jīng)10 s，其后眼表涂紅霉素眼膏。次日觀察術(shù)眼，瞳孔散大，直接對光反射消失，間接對光反射存在，直接檢眼鏡下觀察視網(wǎng)膜血供良好，眼球無明顯突出者為造模成功。

1.2.3 閃光視覺誘發(fā)電位于造模前及造模后 1 d、1周、2周、4周、6周檢測各組大鼠右眼閃光視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential,F-VEP)，具體步驟：以100 g·L-1水合氯醛注射液(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，復(fù)方托品酰氨散瞳。采用銀針電極，阻抗<2 kΩ，暗適應(yīng)后在暗室內(nèi)用全視野閃光刺激器檢查雙眼，頻率2 Hz，通頻帶寬1～100 Hz，分析時間 250 ms，疊加 100 次，連續(xù)測量至少 3次。檢查右眼時，左眼用不透光黑眼罩完全遮蓋。記錄P波的潛伏期和振幅。

1.2.4 HE染色分別于造模后1 d、1周、2周、4周、6周每組各處死2只大鼠，分離暴露并剪斷視神經(jīng)，立即將眼球放入新鮮配制的40 g·L-1多聚甲醛固定液中固定48 h，取出修整后，置于體積分數(shù) 95%酒精過夜，然后置于體積分數(shù)100%Ⅰ、體積分數(shù)100%Ⅱ梯度酒精及二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1 h脫水，62 ℃烤箱浸蠟Ⅰ、蠟Ⅱ、蠟Ⅲ各1 h，石蠟包埋、切片。各組每個時間點隨機取3張切片行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化。

1.2.5 免疫組織化學染色Caspase-3免疫組織化學染色嚴格按照SP試劑盒說明進行。各組每個時間點隨機取1.2.4內(nèi)切片3張，采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機檢測3個區(qū)域平均光密度值，進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點F-VEP變化F-VEP結(jié)果顯示，造模前3組大鼠P波潛伏期間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；造模后，生理鹽水組、藥物組與空白對照組相比P波潛伏期均有延長。造模后1 d、1周、2周，生理鹽水組與藥物組P波潛伏期相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；造模后4周、6周，與生理鹽水組相比，藥物組P波潛伏期明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。見表1。

造模前3組大鼠P波振幅相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。造模后，與空白對照組相比，生理鹽水組、藥物組P波振幅均有先升高后降低的趨勢。藥物組、生理鹽水組在造模后1 d、1周與空白對照組相比，P波振幅均略有升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。造模后2周、4周、6周，藥物組和生理鹽水組P波振幅均下降，特別是造模后4周、6周生理鹽水組P波振幅下降更明顯，而藥物組趨于平穩(wěn)，兩組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠不同時間點F-VEP的P波潛伏期

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學觀察HE染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠視網(wǎng)膜層次清晰，細胞排列整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層單層排列，無明顯壞死細胞；生理鹽水組和藥物組造模后1 d可見視網(wǎng)膜明顯水腫、厚度增加，部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞出現(xiàn)空泡樣改變；生理鹽水組隨時間推移，視網(wǎng)膜厚度變薄，組織萎縮，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生空泡樣改變的比例增加；藥物組造模后1周視網(wǎng)膜水腫減輕，造模后2周、4周、6周空泡樣改變的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少，細胞形態(tài)逐漸接近空白對照組(圖1)。

表2 各組大鼠不同時間點F-VEP的P波振幅

圖1 各組視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×200)。A：空白對照組；B：藥物組；C：生理鹽水組(1-5分別代表造模后1 d、1周、2周、4周及6周)

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜中Caspase-3蛋白表達結(jié)果Caspase-3陽性表達細胞為細胞質(zhì)內(nèi)棕黃色或褐色染色。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，空白對照組未見Caspase-3蛋白明顯表達，生理鹽水組及藥物組在造模后1 d Caspase-3蛋白開始表達。造模后1周達到峰值，而后逐漸減少。造模后2周、4周、6周，生理鹽水組Caspase-3蛋白表達均明顯高于藥物組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)；隨時間推移，藥物組Caspase-3蛋白表達逐漸減少，造模后4周時 Caspase-3蛋白表達量接近空白對照組。見表3。

表3 各組大鼠造模后不同時間點Caspase-3蛋白的表達

3 討論

外傷性視神經(jīng)病變在中醫(yī)中屬“撞擊暴盲”或“青盲”范疇?！蹲C治準繩》稱之為“觸傷真氣證”，認為本證為“打動珠中真氣、絡(luò)澀滯而郁遏，精華不得上運，損及瞳神而為內(nèi)障之急”。根據(jù)中醫(yī)氣虛理論，我們認為外傷后眼中真氣受損，氣虛不能推動血脈運行，致使目系脈絡(luò)淤滯；或外傷損及目系，脈絡(luò)受損，血溢絡(luò)外，導(dǎo)致血淤，兩者均導(dǎo)致目系失養(yǎng)，后期發(fā)生視神經(jīng)萎縮。本病的病理機制為：氣虛血淤，為本虛標實之證，確定補氣活血為治療本病之大法。

目前，大量研究表明，中藥在外傷性視神經(jīng)病變中起到積極的治療作用。孔祥梅等[8]觀察甲鈷胺治療鉗夾傷的SD大鼠發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)軸突和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞異形改變明顯減少，有效延緩了視神經(jīng)的進一步損傷。肖家翔等[9]采用養(yǎng)血行血方治療鉗夾傷的大鼠，結(jié)果表明，造模后大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度增加，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞腫脹，呈空泡樣變性，而養(yǎng)血行血方改善了視網(wǎng)膜的病理改變。

本研究建立鉗夾視神經(jīng)挫傷的大鼠模型，采用加味補陽還五湯進行灌胃處理，觀察視神經(jīng)損傷程度及修復(fù)機制。加味補陽還五湯以補陽還五湯為主，加丹參藥物組成。補陽還五湯始載于《醫(yī)林改錯》，具有補氣活血，通經(jīng)活絡(luò)的作用。補陽還五湯中重用黃芪為君藥，取其補氣以行血通絡(luò)之意。丹參具有活血通絡(luò)、去淤止痛之功效。加味補陽還五湯具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)、益精明目之功效。根據(jù)中醫(yī)氣血理論，氣為血行之動力，氣行則血行，氣滯則血淤；該方立法為補氣活血，尤其強調(diào)補氣的重要作用。

F-VEP檢測主要反映視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞至視覺中樞的傳遞功能，其在鑒別偽盲、視神經(jīng)挫傷中具有重要的作用[10]。本研究F-VEP結(jié)果顯示，造模后 1 d，生理鹽水組和藥物組P波潛伏期均明顯延長，考慮與視神經(jīng)鉗夾所致直接的機械壓迫效應(yīng)造成軸突的急劇損傷有關(guān)。造模后1周生理鹽水組P波潛伏期變化平穩(wěn)，而藥物組在造模后4周、6周時P波潛伏期明顯縮短，但與空白對照組相比仍有一定差距，考慮在藥物輔助下部分視神經(jīng)功能得到恢復(fù)，但仍有部分視神經(jīng)的受損是不可逆的。

HE染色結(jié)果顯示，視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜水腫，與機械性沖擊、壓迫等原因造成視神經(jīng)挫傷引起的病理改變有關(guān)。造模后4周，藥物組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞部分恢復(fù)，組織結(jié)構(gòu)清晰，尚可見部分細胞呈空泡樣改變；而生理鹽水組可見大量神經(jīng)節(jié)細胞空泡樣改變，且視網(wǎng)膜厚度變薄，組織萎縮。

細胞凋亡在視神經(jīng)損傷修復(fù)過程中具有重要的作用。Caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶，常以無活性的酶原形式存在，只有在凋亡信號出現(xiàn)時才發(fā)生裂解而活化[11]。劉曉坤等[12]研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠視網(wǎng)膜幾乎無Caspase-3表達，視神經(jīng)鉗夾傷后可見視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)大量Caspase-3陽性染色細胞，主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層及外核層，損傷后7 d達到峰值，隨后表達下降。本研究結(jié)果與之一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)損傷后2周、4周、6周生理鹽水組Caspase-3蛋白表達均明顯高于藥物組，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)?？紤]原因為，早期視神經(jīng)損傷主要是鉗夾視神經(jīng)造成部分神經(jīng)纖維軸漿運輸阻斷，部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞失去營養(yǎng)供給，發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的死亡，而另一部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞因為組織水腫、炎癥等微環(huán)境的改變，誘導(dǎo)細胞凋亡機制的發(fā)生，造成視神經(jīng)的繼發(fā)性損害。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，加味補陽還五湯在視神經(jīng)挫傷的修復(fù)過程中能改善視神經(jīng)的損傷，促進神經(jīng)修復(fù)，并且通過抑制細胞凋亡分子的表達，為神經(jīng)損傷修復(fù)提供良好的微環(huán)境。本實驗為加味補陽還五湯在外傷性視神經(jīng)損傷中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，為臨床治療外傷性視神經(jīng)損傷提供了新的思路。