基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌活性成分及作用機(jī)制研究

邱瓊?cè)A，毛桂福，梁學(xué)政，韋倩，李雋永，覃世逆

1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 柳州 545001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545005

肝癌是目前我國(guó)第4位常見(jiàn)惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命和健康，主要包括肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC混合型3種不同病理學(xué)類(lèi)型，其中HCC占85%～90%，是肝癌最常見(jiàn)的類(lèi)型[1]。目前肝癌的早期治療以外科手術(shù)為主，中晚期則主要運(yùn)用局部消融、放射及系統(tǒng)治療等手段，有一定局限性，不良反應(yīng)較多。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合運(yùn)用于肝癌治療的不同階段，能夠起到增效減毒，提升患者生存率及改善患者生活質(zhì)量的目的[2]。

在中醫(yī)學(xué)中，肝癌歸屬于“積聚”“肝積”“黃疸”“鼓脹”“暴癥”等病的范疇，“肝藏血，主疏泄”，中醫(yī)認(rèn)為情志郁結(jié)將導(dǎo)致肝氣疏泄無(wú)權(quán)，易氣郁化火，故肝癌后期容易出現(xiàn)肝熱血瘀之象，治療上宜清熱化瘀。山慈菇味甘，性辛涼，歸肝、脾經(jīng)，有清熱解毒，化痰散結(jié)之功，《本草拾遺》曰：“山慈菇尤擅療癰腫瘡瘺，瘰疬結(jié)核”等；半枝蓮味辛苦，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，有清熱解毒，化瘀止血的功效，臨床上二者常共同用于肝癌的治療[3-5]，如林麗珠、尹常健常使用該藥對(duì)治療熱毒熾盛的肝癌患者，療效明顯?，F(xiàn)代研究顯示，山慈菇主要含有菲類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、多糖類(lèi)以及甾體類(lèi)化合物，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6-7]。半枝蓮主要含有黃酮類(lèi)、二萜及其內(nèi)酯類(lèi)成分，是公認(rèn)的抗癌中藥，在肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肺癌、白血病等多種癌癥治療中有顯著的效果[8]。但二者以藥對(duì)聯(lián)合使用的抗肝癌研究未見(jiàn)報(bào)道，其抗肝癌的作用靶點(diǎn)及機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明?；诖?，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“山慈菇-半枝蓮”的“活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)，分析“山慈菇-半枝蓮”的核心活性成分及抗肝癌的潛在作用靶點(diǎn)，為深入研究“山慈菇-半枝蓮”的抗肝癌機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 “山慈菇-半枝蓮”活性成分及靶點(diǎn)的篩選

以“山慈菇”“半枝蓮”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/）檢索兩藥物的化學(xué)成分，收集其藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以口服生物利用度（bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（druglikeness，DL）≥0.18作為活性化合物的篩選標(biāo)準(zhǔn)[9]，獲得“山慈菇-半枝蓮”活性化合物。之后運(yùn)用TCMSP篩選出活性化合物的靶點(diǎn)基因，并借助UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將靶基因全稱(chēng)轉(zhuǎn)換為通用簡(jiǎn)寫(xiě)，去除無(wú)靶點(diǎn)的化合物，得到“山慈菇-半枝蓮”活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）用關(guān)鍵詞“l(fā)iver carcinoma”進(jìn)行檢索及篩選，獲取肝癌相關(guān)疾病靶點(diǎn)。然后將“山慈菇-半枝蓮”活性成分靶點(diǎn)與肝癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射構(gòu)建韋恩圖，提取共同的靶基因，將交集靶基因上傳到String網(wǎng)站（https://string-db.org/），運(yùn)用軟件中的“Multiple Proteins”項(xiàng)，設(shè)置蛋白相互作用最低分?jǐn)?shù)為0.7進(jìn)行篩選分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。

1.3 核心靶基因的篩選

將1.2的PPI結(jié)果導(dǎo)入cytoscape軟件，結(jié)合軟件中的Deg（degree）、MCC（maximal clique centrality）、DMNC（density of maximum neighborhood component）、EPC（edge percolated component）、BC（Betweenness）、Clo（Closeness）六種算法[10]，獲得六種算法中各排列前50的靶基因，構(gòu)建韋恩圖，取其交集靶基因，即為“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌的核心靶基因。

1.4 靶點(diǎn)基因功能注釋和通路富集分析

通過(guò)DAVID軟件（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）和R軟件的ClusterProfiler數(shù)據(jù)包對(duì)篩選出的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的篩選條件，得到“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌的生物過(guò)程及相關(guān)信號(hào)通路，并對(duì)其進(jìn)行可視化處理。

1.5 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用軟件Cytoscape構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)以闡明“山慈菇-半枝蓮”中活性成分與疾病靶點(diǎn)的關(guān)系。以網(wǎng)絡(luò)下方方形節(jié)點(diǎn)代表篩選后“山慈菇-半枝蓮”與肝癌的共同靶基因，網(wǎng)絡(luò)上方橢圓形節(jié)點(diǎn)代表“山慈菇-半枝蓮”的活性成分，連接線(xiàn)代表“山慈菇-半枝蓮”活性成分與潛在作用靶點(diǎn)的相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 “山慈菇-半枝蓮”活性成分分析

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到“山慈菇-半枝蓮”已報(bào)道的化學(xué)成分112個(gè)，經(jīng)篩選后共得到山慈菇化合物3個(gè)，半枝蓮化合物29個(gè)，有相同化合物2個(gè)，共得到30個(gè)潛在活性成分，詳見(jiàn)表1。

表1 “山慈菇-半枝蓮”主要活性成分Table 1 Main active ingredients of PC-SB

2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

2.2.1 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，獲取肝癌相關(guān)的疾病靶基因分別為16 368和437個(gè)；“山慈菇-半枝蓮”的30個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因去重后為194個(gè)，運(yùn)用R軟件將194個(gè)活性成分靶基因與16 623個(gè)肝癌相關(guān)靶基因進(jìn)行交集并構(gòu)建韋恩圖，得到交集靶基因192個(gè)，即“山慈菇-半枝蓮”潛在抗肝癌作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1?！吧酱裙?半枝蓮”的靶基因幾乎全部與肝癌靶基因關(guān)聯(lián)，表明該藥對(duì)能精準(zhǔn)作用于肝癌相關(guān)靶點(diǎn)。

圖1 “山慈菇-半枝蓮”活性成分與肝癌共同靶點(diǎn)韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the common target of PC-SB and liver carcinoma

2.2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將上述192個(gè)共同靶基因上傳至String平臺(tái)，物種設(shè)定為“homo sapiens”，其余參數(shù)默認(rèn)，獲得蛋白相互作用數(shù)據(jù)信息，得到由192個(gè)節(jié)點(diǎn)及1 281條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。

圖2 “山慈菇-半枝蓮”與肝癌的共同靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network of the common targets between PC-SB and liver carcinoma

2.2.3 核心靶基因的篩選

在上述基礎(chǔ)上通過(guò)cytoscape的cytohubba插件，運(yùn)用Deg、MCC、DMNC、EPC、BC、Clo六種算法，分別獲取各算法前50位的靶基因。其中Deg算法獲取的前5個(gè)靶基因是：AKT1、MAPK1、JUN、IL6、VEGFA；MCC算法獲取的前5個(gè)靶基因是：IL6、CXCL8、JUN、IL-1B、CCL2；DMNC算法獲取的前5個(gè)靶基因是：CHRM4、OPRM1、IL1A、IL2、ERBB3；EPC算法獲取的前5個(gè)靶基因是：MAPK1、JUN、AKT1、IL6、EGFR；BC算法獲取的前5個(gè)靶基因是：AKT1、APP、JUN、MAPK1、IL6；Clo算法獲取的前5個(gè)靶基因是：AKT1、 MAPK1、 JUN、 IL6、 VEGFA。 再通過(guò)jvenn軟件對(duì)各算法獲取的靶基因取交集，得到PTGS2、CXCL8、IL4、IL-1B、HMOX1和IL10等6個(gè)關(guān)鍵靶基因，見(jiàn)圖3。

圖3 六種算法靶基因交集韋恩圖Figure 3 Venn diagram of target gene intersection of six algorithms

2.3 GO功能注釋及相關(guān)通路富集分析

2.3.1 共同靶基因的GO功能富集及注釋

在線(xiàn)david分析結(jié)果顯示，藥物-肝癌共同的192個(gè)靶基因涉及了603個(gè)生物過(guò)程、65個(gè)細(xì)胞組分和131個(gè)分子功能。在生物過(guò)程方面主要涉及對(duì)藥物的反應(yīng)、聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞老化、無(wú)配體時(shí)外源性細(xì)胞凋亡等；在細(xì)胞組分方面主要涉及胞外空間、細(xì)胞質(zhì)、膜筏、核質(zhì)、線(xiàn)粒體外膜、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)的調(diào)控等；在分子功能方面主要有酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合等。

另通過(guò)R軟件的clusterProfiler GO數(shù)據(jù)包對(duì)以上基因功能進(jìn)行GO生物功能注釋?zhuān)⒁訮＜0.05作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)篩選得到175條結(jié)果，對(duì)其排名前20的生物功能進(jìn)行可視化分析，得到GO分析氣泡圖，見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，共同作用的靶基因主要富集在與結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、與結(jié)合DNA的特異性RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）、信號(hào)受體激活酶的活性（signaling receptor activator activity）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、受體配體活性（receptor ligand activity）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）等功能上，涉及基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白的降解、腫瘤微環(huán)境、腫瘤炎癥反應(yīng)、腫瘤免疫抑制以及腫瘤血管生成等生理功能。

圖4 GO功能富集分析圖Figure 4 Visual analysis of GO function enrichment

2.3.2 KEGG通路富集分析

應(yīng)用R軟件中Cluster Profiler KEGG數(shù)據(jù)包對(duì)共同靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)保留P＜0.05的結(jié)果，共富集得到162個(gè)信號(hào)通路，對(duì)其前20個(gè)富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析，得到KEGG分析柱狀圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果如圖所示，AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎信號(hào)通路（Hepatitis B）、白介素-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、丙型肝炎信號(hào)通路（Hepatitis C）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肝細(xì)胞癌信號(hào)通路（Hepatocellular carcinoma）等為“山慈菇-半枝蓮”治療肝癌的關(guān)鍵信號(hào)通路。此外，NF-kB信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）、P53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（vascular endothelial growth factor signaling pathway，VEGF signaling pathway）、EGFR信號(hào)通路、膀胱癌通路、前列腺癌通路、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等通路也被顯著富集。

圖5 KEGG通路富集分析Figure 5 Visual analysis of KEGG pathway enrichment

2.4 “藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將“山慈菇-半枝蓮”的活性成分與共同靶點(diǎn)及其屬性導(dǎo)入到Cytoscape，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖6。根據(jù)Deg排名，選取關(guān)聯(lián)靶基因數(shù)量超過(guò)20的活性成分，分別為槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、胡蘿卜苷以及4，7-二羥基-2-甲氧基-9，10-二氫菲，是抗肝癌的關(guān)鍵活性成分，其與多個(gè)靶基因相關(guān)聯(lián)，見(jiàn)表2。

圖6 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 “Drug-component-target”network

表2 “山慈菇-半枝蓮”核心化合物與相關(guān)靶基因信息Table 2 Core active ingredients and related target gene information of PC-SB

3 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中乙肝病毒引起的慢性肝損傷是肝癌發(fā)生的主要因素，此外丙型肝炎病毒感染、乙醇濫用、黃曲霉毒素食物攝入、非乙醇性脂肪肝損傷等均是肝細(xì)胞癌發(fā)生的病因[11]，近年來(lái)有關(guān)肝癌的發(fā)病機(jī)制研究顯示，肝癌的發(fā)生與多種基因調(diào)控的各種細(xì)胞信號(hào)通路、外泌體、Toll樣受體、自噬等有關(guān)[12-13]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討“山慈菇-半枝蓮”治療肝癌的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，篩選出“山慈菇-半枝蓮”活性成分30個(gè)，肝癌靶點(diǎn)192個(gè)，涉及162個(gè)信號(hào)通路，進(jìn)一步篩選得出核心化合物7個(gè)，核心靶基因6個(gè)，GO富集結(jié)果顯示肝癌靶基因主要參與DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白降解、炎癥反應(yīng)、免疫抑制以及血管的生成等生理功能，涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路，IL-17、TNF、PI3K-Akt、NF-kB等信號(hào)通路，體現(xiàn)了“山慈菇-半枝蓮”多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療肝癌的特點(diǎn)。具體如下：

本研究通過(guò)“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”圖，獲得“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌的7個(gè)核心活性成分，分別為槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇、胡蘿卜苷以及4，7-二羥基-2-甲氧基-9，10-二氫菲等，其中槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、黃芩素等均屬于黃酮類(lèi)化合物，研究顯示槲皮素可抑制IL-1β、IL-6、IL-10和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的合成，從而抑制PI3K/Akt/NF-κB和STAT3等通路以減少肝臟炎癥反應(yīng)，降低肝癌發(fā)生率[14]；漢黃芩素能通過(guò)能抑制EGFR系列信號(hào)通路的磷酸化而抑制新生血管的生長(zhǎng)，從而抑制肝癌細(xì)胞系的增殖和侵襲[15]；黃芩素能抑制肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控PI3K-AKT通路有關(guān)[16]，且黃芩素還能影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬等多種生物過(guò)程而發(fā)揮抗癌活性[17]，綜上推測(cè)“山慈菇-半枝蓮”藥對(duì)可能主要通過(guò)上述7個(gè)核心活性成分發(fā)揮抗肝癌作用，是該藥對(duì)抗肝癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)PPT網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D及Deg、MCC、DMNC等六種算法交集得到6個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為PTGS2、CXCL8、IL4、IL-1B、HMOX1 和 IL10，它們是與細(xì)胞增殖、炎癥相關(guān)的主要靶點(diǎn)。研究顯示，在肝癌中炎癥可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與存活，且炎癥能通過(guò)影響免疫調(diào)控使得腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。據(jù)報(bào)道，前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（Prostaglandin endoperoxide synthase 2 PTGS2）在人類(lèi)許多良性癌前病變和惡性腫瘤中均有高表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)的PTGS2能使其線(xiàn)粒體功能發(fā)生障礙而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]；HMOX1（Heme Oxygenase 1）屬于血紅素加氧酶家族，高表達(dá)的HMOX1與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[19]；CXCL8、IL4、IL-1β和IL10均屬于白介素家族，在多種類(lèi)型的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)它們的過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，這種過(guò)表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥、炎癥反應(yīng)及血管新生等進(jìn)程[20-22]，已有研究報(bào)道肝癌組織中IL4、IL10等的升高使得機(jī)體中Th1/Th2比例的失衡，導(dǎo)致腫瘤免疫耐受的發(fā)生[23-24]；類(lèi)似的IL-1β在肝癌細(xì)胞表達(dá)異常升高時(shí)，能夠削弱機(jī)體NK細(xì)胞天然免疫應(yīng)答，造成肝癌細(xì)胞的免疫逃逸。以上分析結(jié)合本文GO功能富集結(jié)果，推測(cè)“山慈菇-半枝蓮”的活性成分主要通過(guò)抑制PTGS2、HMOX1、IL4等核心靶點(diǎn)的過(guò)表達(dá)，影響DNA、RNA轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、調(diào)節(jié)信號(hào)受體激活酶的活性、介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白降解，參與腫瘤微環(huán)境、炎癥反應(yīng)、血管生成等生理功能，最終抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲。

為進(jìn)一步分析“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌的作用機(jī)制，對(duì)KEGG富集的信號(hào)通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)“山慈菇-半枝蓮”能調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用，其中與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移，腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)血管新生的PI3K-Akt、IL-17、TNF、NF-κB、VEGF、P53、MAPK等信號(hào)通路被顯著富集。已有證據(jù)顯示PI3K-Akt信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移以及腫瘤血管生成密切相關(guān)，該通路在許多腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)被高度激活，其中肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的四跨膜蛋白CD151可激活PI3KAkt信號(hào)通路，加快腫瘤血管形成、促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[25]，而活化的PI3K-Akt還可通過(guò)TSC1/2復(fù)合物進(jìn)一步激活下游mTOR蛋白激酶，促使nPKCd的磷酸化，從而加速蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖。p53則是目前研究發(fā)現(xiàn)的最重要的腫瘤抑制因子之一，擁有細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞增殖的功能，據(jù)報(bào)道至少50%癌癥患者中p53發(fā)生突變或者功能喪失[26]，突變后的p53除了失去野生型的腫瘤抑制功能外，通常還獲得新的致癌功能。MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)和參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和凋亡等過(guò)程，異常活化的MAPK能激活下游通路的蛋白激酶，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[27-28]。

近年來(lái)，炎癥，特別是持續(xù)的慢性炎癥，已經(jīng)被證實(shí)在肝癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。腫瘤微環(huán)境中存在著大量的炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞，這些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和腫瘤之間相互作用，共同構(gòu)成了復(fù)雜的腫瘤炎癥微環(huán)境，影響著腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程。研究顯示，在腫瘤炎癥微環(huán)境中促炎因子TNF-α和抗炎因子如TGF-β、IL-4、IL-10等的含量比例失衡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[29]。本研究中乙型肝炎、丙型肝炎、IL-17、TNF、NF-kB等多條信號(hào)通路被顯著富集，顯示“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌的作用與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。研究顯示多數(shù)炎癥因子通過(guò)激活NF-κB通路發(fā)揮作用，如TNF-α、IL-1等信號(hào)因子可激活NF-κB通路，誘導(dǎo)多種趨化因子和黏附因子的表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)的微環(huán)境[30]。在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，許多因素都可能激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖與抗凋亡、加速血管生成、浸潤(rùn)等生理過(guò)程。此外，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒慢性感染后的炎癥微環(huán)境是肝癌發(fā)展的重要因素，研究顯示HBV和HCV感染導(dǎo)致的HCC占全球HCC病例數(shù)的80%左右[31]。

此外，在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞維持其異常生長(zhǎng)的重要途徑是促進(jìn)血管新生，VEGF、Wnt/βcatenin（Wnt/β-連環(huán)蛋白通路）、PI3K-AKT等多個(gè)信號(hào)通路參與該過(guò)程，對(duì)血管新生的各個(gè)階段產(chǎn)生影響。其中VEGF聯(lián)系眾多信號(hào)通路，對(duì)血管新生的過(guò)程發(fā)揮了不可替代的作用[32]。VEGF是機(jī)體內(nèi)常見(jiàn)的同源二聚體糖蛋白，也是目前發(fā)現(xiàn)對(duì)血管生成具有最強(qiáng)促進(jìn)作用的因子，當(dāng)VEGF/VEGFR通路激活后，完成下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，促進(jìn)原有血管基礎(chǔ)上的有絲分裂，增加血管通透性，促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)。大量研究顯示，VEGF和VEGFR在肝癌組織中表達(dá)明顯增多，在肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展涉及多個(gè)靶點(diǎn)，多種信號(hào)通路的相互作用，“山慈菇-半枝蓮”的活性成分正是通過(guò)調(diào)節(jié)上述關(guān)鍵靶點(diǎn)，阻斷異常激活的信號(hào)通路，抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白降解、影響細(xì)胞因子受體、受體配體、泛素樣蛋白等因子的活性，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)腫瘤炎癥微環(huán)境，抑制腫瘤組織血管新生，最終發(fā)揮抗肝癌的作用。山慈菇、半枝蓮是臨床常用的抗腫瘤中藥，使用范圍涉及肺癌、肝癌、大腸癌等多種癌癥，現(xiàn)代藥理研究顯示，山慈菇中的生物堿能抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂和增殖，山慈菇多糖可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[33-34]；半枝蓮的水提物則能抑制大鼠肝癌的惡化，其總黃酮可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡[35-36]，本文通過(guò)網(wǎng)路藥理學(xué)研究，對(duì)“山慈菇-半枝蓮”抗肝癌的作用機(jī)制進(jìn)行了探索研究，篩選出“山慈菇-半枝蓮”藥對(duì)的抗肝癌的主要活性成分，進(jìn)一步明確了其抗肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用通路，為后續(xù)深入研究其抗肝癌的機(jī)制提供理論依據(jù)，其中部分通路的調(diào)控作用已在上述文獻(xiàn)研究中得到證實(shí)，將來(lái)需進(jìn)一步對(duì)其他靶點(diǎn)和通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以獲得更為直接的數(shù)據(jù)支撐。