黑豆皮多酚提取物抗氧化活性研究

任曼妮 王存堂 唐旭華 孫 鵬 高曾明

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

黑豆是一年生草本豆科植物，原產(chǎn)于中國(guó)東北三省、安徽、河南、河北、山東等。其形狀多呈扁圓、長(zhǎng)橢圓形或腎狀形。黑豆作為藥食兩用物質(zhì)，歷史久遠(yuǎn)[1]。黑豆?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)豐富，被譽(yù)為“植物蛋白之王”[2]。此外，黑豆還富含植物活性物質(zhì)，具有比其他可食用豆類更高的酚類物質(zhì)和抗氧化性[3]，且這些酚類物質(zhì)多集中在黑豆皮中[4]。

Xu等[5]通過(guò)HPLC從黑豆中分析出12種異黃酮類化合物；Feng等[6]通過(guò)HPLC從黑豆中鑒定出4種異黃酮；Lee等[7]分析了黑豆中花青素的組成。研究[5,8]表明，黑豆皮所富含的酚類化合物使得黑豆比其他豆類具有更高的自由基清除能力和總抗氧化能力。黑豆皮中的酚類物質(zhì)具有很多生物活性，如抗輻射、抗氧化、抗脂肪和降血脂、降血糖、促進(jìn)傷口愈合、抗炎等。Kwon等[9]通過(guò)高脂肪喂養(yǎng)小鼠，表明黑豆皮提取物可以轉(zhuǎn)變高脂肪飲食對(duì)體重、血清脂質(zhì)的影響；Wang等[10]通過(guò)建立高血糖小鼠模型，證明了黑豆皮提取物具有改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠高血糖癥狀。此外，Nizamutdinova等[11]發(fā)現(xiàn)黑豆皮提取物對(duì)傷口愈合有促進(jìn)作用。

試驗(yàn)擬以黑豆皮為原料，分別利用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇、乙醇和丙酮作為提取溶劑進(jìn)行多酚類物質(zhì)提取，測(cè)定提取物中總酚、總黃酮含量及抗氧化活性，為黑豆?fàn)I養(yǎng)功能的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黑豆皮：市售，粉碎，過(guò) 80 目篩備用；

ABTS、DPPH：分析純，美國(guó) Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司；

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、Folin-酚試劑、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、碳酸鈉、丙酮、甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵：分析純，天津凱通化學(xué)試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-5100型，上海元析儀器有限公司；

高速離心機(jī)：LG10-24A型，北京京立離心機(jī)有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-200A型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ-25C型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮多酚類物質(zhì)的提取 稱取0.5 g黑豆皮粉，分別用20 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇、甲醇、丙酮避光震動(dòng)提取20 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀用同樣的方法再次提取，合并兩次所得上清液，50 ℃真空下濃縮2 h，再轉(zhuǎn)至-40 ℃真空干燥48 h。粉末于-20 ℃密封儲(chǔ)存?zhèn)溆谩０词?1)計(jì)算多酚物質(zhì)得率。

(1)

式中：

c——多酚物質(zhì)得率，g/100 g；

m1——提取物干粉質(zhì)量，g；

m2——黑豆皮干粉質(zhì)量，g。

1.2.2 總酚含量測(cè)定 采用福林酚法，參考Xue等[12]方法并稍作修改。取0.15 mL提取液稀釋至0.1 mg/mL，于10 mL具塞比色管中，加入10倍稀釋的0.2 mol/L福林酚試劑，利用渦旋混勻器混勻，靜置5 min。然后加入6%(體積分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液1.5 mL，將此混合液于75 ℃下水浴10 min，隨后立即冰浴終止反應(yīng)，用蒸餾水定容至刻度。于725 nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光值。同時(shí)以0.15 mL甲醇代替提取液作空白對(duì)照，配置不同濃度梯度沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.031x+0.013，R2=0.998)?？偡雍恳悦靠撕诙蛊ぬ崛∥锔苫兴瑳](méi)食子酸當(dāng)量的毫克數(shù)表示，重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 參考Zhang等[13]的三氯化鋁分光光度法略加改動(dòng)。取1 mL提取液稀釋至0.1 mg/mL，于10 mL具塞比色管中，加入5 g/L NaNO2溶液0.3 mL搖勻，靜置6 min后再加入10 g/L AlCl3·6H2O溶液0.3 mL，靜置6 min。加入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液4.0 mL，用蒸餾水定容，靜置15 min，于510 nm下測(cè)其吸光值。同時(shí)以1 mL甲醇代替提取液作空白對(duì)照，配置不同濃度梯度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.016x-0.012，R2=0.998)，總黃酮含量以每克黑豆皮提取物干基中蘆丁當(dāng)量毫克數(shù)表示。重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4 DPPH自由基清除性能測(cè)定 參考Bakar等[14]的方法并略有改動(dòng)。吸取0.4 mL不同濃度(0.012 5～0.200 0 mg/mL)提取液于試管中，再加入0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液4.5 mL (Abs為1.00±0.02，臨用現(xiàn)配)，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，517 nm下測(cè)定吸光度值，配置不同濃度的抗壞血酸(0.012 5～0.200 0 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率[15]。

(2)

式中：

k——自由基清除率，%；

A2——對(duì)照組吸光度值；

A1——樣品組吸光度值。

1.2.5 ABTS自由基清除性能測(cè)定 參考Re等[16]和李青等[17]的方法并略有改動(dòng)。將7 mmol/L ABTS水溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，避光放置12～16 h，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。用無(wú)水乙醇稀釋，734 nm下調(diào)其吸光度為(0.700±0.020)，得ABTS+自由基工作液，于30 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。吸取不同濃?0.012 5～0.100 0 mg/mL)提取液加入ABTS+自由基工作液1 mL混合均勻，避光放置30 min后，于734 nm下測(cè)其吸光度值，以甲醇為空白對(duì)照，以不同濃度的抗壞血酸(0.012 5～0.200 0 mg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照。重復(fù)測(cè)定3次。按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

1.2.6 鐵還原能力測(cè)定 參考Benzie等[18]方法并略有改動(dòng)。300 mmol/L pH 3.6醋酸鈉緩沖液、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3溶液，按照體積比10∶1∶1混合，混勻后于37 ℃水浴備用。吸取120 μL不同濃度(0.012 5～0.200 0 mg/mL)提取液，加入去離子水360 μL及FRAP溶液3.6 mL?；靹蚝笥?7 ℃水浴30 min，593 nm測(cè)定吸光值，重復(fù)測(cè)量3次，并以抗壞血酸代替提取物作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光度值越大，表明鐵還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚得率、總酚含量和總黃酮含量

由表1可知，丙酮提取物的多酚得率最高，為(11.23±0.05) mg/100 g。不同溶劑提取物中總酚含量、總黃酮含量大小順序?yàn)椋罕崛∥?乙醇提取物>甲醇提取物，且不同溶劑提取物中總酚含量、總黃酮含量存在顯著差異。

表1 黑豆皮不同溶劑提取物的多酚得率、總酚含量和總黃酮含量?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 DPPH自由基清除性能

由圖1可知，丙酮提取物中DPPH自由基清除能力IC50最低[(0.059±0.005) mg/mL]，表明丙酮提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，甲醇與乙醇提取物的DPPH自由基清除能力無(wú)顯著差異，均低于抗壞血酸DPPH自由基清除能力[(0.021±0.004) mg/mL]。

圖1 黑豆皮不同溶劑提取物的DPPH自由基清除性能

Figure 1 DPPH radical scavenging activities of black soybean seed coat with different solvents

2.3 ABTS自由基清除性能

由圖2可知，丙酮提取物中ABTS自由基清除能力IC50最低[(0.057±0.004) mg/mL]，表明丙酮提取物的ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，甲醇與乙醇提取物的ABTS自由基清除能力無(wú)顯著差異，均低于抗壞血酸ABTS自由基清除能力[(0.017±0.002) mg/mL]。

圖2 黑豆皮不同溶劑提取物的ABTS自由基清除性能

Figure 2 ABTS radical scavenging activity of solvent extracts prepared from black soybean seed coat

2.4 鐵還原能力

由圖3可知，所有提取液均表現(xiàn)出一定程度的鐵還原能力，呈線性濃度依賴性，且提取物的鐵還原能力顯示出與DPPH和ABTS自由基清除活性相似的趨勢(shì)。在相同的質(zhì)量濃度時(shí)，鐵還原能力大小順序?yàn)椋罕崛∥?甲醇提取物>乙醇提取物。

圖3 黑豆皮不同溶劑提取物的鐵還原能力

Figure 3 Ferric reducing antioxidant power of different solvents from black soybean seed coat

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)體積分?jǐn)?shù)均為70%時(shí)，丙酮提取物中多酚類物質(zhì)含量(總酚、總黃酮)、抗氧化性均高于甲醇、乙醇提取物。黑豆皮富含多酚類物質(zhì)，可應(yīng)用于功能性食品或作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化添加劑。試驗(yàn)僅對(duì)黑豆皮中多酚類物質(zhì)總含量進(jìn)行了測(cè)定，其功能性多酚單體的種類、含量及其多酚化合物代謝路徑有待深入研究。