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    糖基化改性對(duì)酪蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

    2019-11-16 03:12:54趙玉濱穆秋霞曲柳青崔素萍
    食品與機(jī)械 2019年10期
    關(guān)鍵詞:木糖酪蛋白糖基化

    趙玉濱 穆秋霞 曲柳青 崔素萍

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 大慶 163319)

    美拉德反應(yīng)(Maillardreaction,MR)是指食品中羰基化合物與氨基化合物發(fā)生的羰氨縮合反應(yīng)[1],又稱蛋白質(zhì)或氨基酸的糖基化改性反應(yīng)。美拉德反應(yīng)不但可以改善食品的顏色和風(fēng)味,而且其反應(yīng)產(chǎn)物還具有抗氧化活性等,Hodge[2]認(rèn)為美拉德反應(yīng)會(huì)生成類黑精色素及其他高分子雜環(huán)化合物;孫常雁等[3]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)具有較強(qiáng)的總還原力、羥基自由基清除能力,且抗氧化活性隨著乳清蛋白肽美拉德反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加而加強(qiáng);劉蒙蒙[4]研究發(fā)現(xiàn)羅非魚皮膠原蛋白肽—葡萄糖MRPs抗氧化活性隨加熱時(shí)間的延長以及葡萄糖濃度增加而提高,且在堿性介質(zhì)中產(chǎn)物活性較高;錢森和等[5]發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)能夠有效增強(qiáng)芝麻多肽的抗氧化活性;項(xiàng)惠丹等[6]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白與還原糖反應(yīng)的MRPs抗氧化性均低于酪蛋白制備的MRPs,且兩種MRPs都有較強(qiáng)的抗氧化活性;Lertittikul等[7]在研究豬血紅蛋白和葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后,發(fā)現(xiàn)不同pH和加熱時(shí)間對(duì)MRPs的抗氧化能力都有顯著影響。Dong等[8]研究發(fā)現(xiàn)水解β-乳球蛋白與葡萄糖經(jīng)美拉德反應(yīng)后,MRPs的抗氧化能力顯著提高。

    現(xiàn)有研究主要集中在某單一的反應(yīng)物種類及反應(yīng)條件對(duì)MRPs的抗氧化活性的影響,尚未見對(duì)反應(yīng)物種類和反應(yīng)條件對(duì)MRPs抗氧化活性的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。試驗(yàn)擬將酪蛋白堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物與還原糖(葡萄糖、果糖、木糖)在不同反應(yīng)pH、溫度和時(shí)間下建立糖基化反應(yīng)體系,系統(tǒng)分析還原糖種類和反應(yīng)條件對(duì)酪蛋白堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性的影響,并優(yōu)化反應(yīng)條件,以期對(duì)今后的糖基化產(chǎn)物的應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    酪蛋白:生化試劑,天津市大茂化學(xué)試劑廠;

    2709堿性蛋白酶(2.0×105U/g):生化試劑,北京鴻潤寶順科技有限公司;

    葡萄糖、果糖、木糖:分析純,山東省龍力生物科技股份有限公司;

    水楊酸:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    硫酸亞鐵、抗壞血酸、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、過氧化氫:分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

    1.2 試驗(yàn)儀器

    紫外分光光度計(jì):INESA-L5型,上海儀電分析儀器有限公司;

    油浴鍋:DF-1型,金壇市虹盛儀器廠;

    分析天平:BSA124S型,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;

    水浴鍋:XMTD-204型,江蘇科析儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 酪蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的制備 將酪蛋白與蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為5%的溶液,然后用1 mol/L NaOH調(diào)pH至10,加入4 000 U/mL的堿性蛋白酶,在55 ℃酶解3 h,然后在90 ℃水浴10 min,即得酪蛋白酶解液,酶解液冷凍干燥備用。

    1.3.2 糖基化改性的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性為指標(biāo),進(jìn)行單因素試驗(yàn)條件的篩選。按糖與酪蛋白質(zhì)量比為2∶1的比例,準(zhǔn)確稱量2 g葡萄糖、木糖和果糖分別溶于酪蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物溶液中,進(jìn)行糖基化改性。待完全溶解后調(diào)pH為7.0,8.0,9.0,10.0,在110 ℃下反應(yīng)2 h,確定最佳pH;調(diào)pH為10.0,在100,110,120,130 ℃恒溫下反應(yīng)2 h,確定最佳反應(yīng)溫度;調(diào)pH為10.0,在110 ℃恒溫下反應(yīng)2,3,4,5 h,確定最佳反應(yīng)時(shí)間。以上每個(gè)處理做3次重復(fù)。

    1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取最優(yōu)還原糖、pH、溫度和時(shí)間,每個(gè)單因素確定3個(gè)較優(yōu)水平。采用三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以選擇最優(yōu)抗氧化的糖基化反應(yīng)條件。

    1.3.4 糖基化改性產(chǎn)物抗氧化活性的測定

    (1) 清除羥基自由基活性:取50 μL糖基化反應(yīng)產(chǎn)物(0.05 g/mL),加水定容至2 mL,稀釋40倍,剩余步驟見文獻(xiàn)[9]。

    (2) 還原力:取20 μL糖基化反應(yīng)產(chǎn)物(0.05 g/mL),加水定容至2 mL,稀釋100倍,剩余步驟見文獻(xiàn)[9]。

    以未經(jīng)處理的酪蛋白酶解液為對(duì)照樣品。

    1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析方法 用Microsoft Excel 2010及IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH對(duì)糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率和還原力的影響

    如表1所示,酶解產(chǎn)物與木糖、果糖的糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除能力在pH 7.0時(shí)最高,分別是38.63%和32.82%,高于對(duì)照且與其他試驗(yàn)組差異顯著(P<0.05)。與葡萄糖的糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除能力隨pH的升高變化無規(guī)律,其中pH 7.0和pH 9.0之間差異不顯著(P>0.05),而pH 9.0和 pH 10.0之間差異顯著(P<0.05);在pH 10.0時(shí)清除率最高為25.67%,但仍低于對(duì)照,說明葡萄糖和酪蛋白酶解物糖基化產(chǎn)物的自由基清除率較低??梢猿醪酵茢啵咸烟遣⒉贿m于通過糖基化來提高酪蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性。綜上所述,pH 7.0是木糖和果糖通過糖基化來提高酪蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性的最佳pH。

    表1pH對(duì)不同還原糖糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率的影響?

    Table1EffectsofpHonthescavengingrateofhydroxylradicalsofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts %

    pH值葡萄糖木糖果糖7.020.87±0.49b38.63±3.70a32.82±1.46a8.023.13±3.09ab32.67±1.79b22.80±1.97b9.020.33±0.40b30.90±1.55b18.27±6.88b10.025.67±0.68a33.00±2.46b24.13±4.06b

    ? 對(duì)照樣品對(duì)羥基自由基清除率為(29.02±1.57)%;同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    從表2可以看出,酪蛋白酶解物與3種糖的糖基化產(chǎn)物的還原能力在試驗(yàn)pH范圍內(nèi)差異基本不顯著(P>0.05)(果糖在pH 7.0還原力偏低)。結(jié)合表1、2,pH 7.0是葡萄糖、木糖通過糖基化來提高酪蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性的最佳pH。

    表2pH對(duì)不同還原糖糖基化產(chǎn)物還原能力的影響?

    Table2EffectsofpHonthereducingpowerofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts

    pH值葡萄糖木糖果糖7.00.71±0.01a0.75±0.20a0.46±0.05b8.00.93±0.45a0.87±0.16a0.67±0.13ab9.00.74±0.04a0.93±0.03a0.85±0.12a10.00.79±0.13a0.84±0.15a0.76±0.16a

    ? 對(duì)照樣品還原力0.63±0.03;同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    2.2 溫度對(duì)糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率和還原能力的影響

    由表3、4可知,當(dāng)溫度由100 ℃升至110 ℃時(shí),酪蛋白酶解物與3種糖的糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率隨溫度的提高變化差異基本不顯著(除果糖略有差異外),還原能力隨溫度的變化差異也不顯著;但均顯著低于120 ℃和130 ℃的結(jié)果(P>0.05);3種糖的糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率均低于對(duì)照,而還原能力低于或略大于對(duì)照。當(dāng)溫度由120 ℃升至130 ℃時(shí)糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率和還原力均高于對(duì)照。

    章銀良等[10]研究溫度對(duì)酪蛋白—木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高,糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除能力和還原力都增強(qiáng);劉海梅等[11]發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高,葡萄糖—牡蠣酶解液的糖基化產(chǎn)物還原力增強(qiáng),與試驗(yàn)結(jié)果基本一致。綜上所述,120~130 ℃ 是葡萄糖、木糖和果糖通過糖基化來提高酪蛋白水解產(chǎn)物抗氧化性的最適溫度范圍。

    表3溫度對(duì)不同還原糖糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率的影響?

    Table3Effectsoftemperatureonhydroxylradicalscavengingrateofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts %

    溫度/℃葡萄糖木糖果糖10024.27±2.56c24.63±0.61b23.10±2.17b11021.87±1.20c25.63±4.29b27.47±1.54ab12041.77±1.11b58.77±7.19a48.27±1.89ab13076.40±4.59a67.17±10.03a56.27±31.52a

    ? 對(duì)照樣品對(duì)羥基自由基清除率為(29.02±1.57)%;同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    表4溫度對(duì)不同還原糖糖基化產(chǎn)物還原能力的影響?

    Table4Effectsoftemperatureonthereducingpowerofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts

    溫度/℃葡萄糖木糖果糖1000.51±0.09b0.97±0.17c0.64±0.12b1100.54±0.15b0.56±0.14c0.64±0.17b1201.73±0.07a1.45±0.39b0.82±0.18ab1302.00±0.26a2.24±0.05a1.09±0.34a

    ? 對(duì)照樣品還原力0.63±0.03;同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率和還原能力的影響

    反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率和還原能力的影響見表5、6。在反應(yīng)前4 h內(nèi),酪蛋白酶解物與3種糖的糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率和還原力基本隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加;在4 h時(shí),3種糖的糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率和還原力均達(dá)到最高,且均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。3種糖的糖基化產(chǎn)物,在反應(yīng)3 h和 4 h時(shí)的羥基自由基清除率均高于對(duì)照,雖然果糖3 h的糖基化產(chǎn)物在檢測羥基自由基清除率是誤差較大,但是與還原力檢測結(jié)果一致,在反應(yīng)2~3 h時(shí)都無顯著差異(P>0.05);在反應(yīng)2~5 h時(shí)的還原能力均高于對(duì)照。這是因?yàn)槊览路磻?yīng)達(dá)到一定時(shí)間后,美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物與氨基化合物進(jìn)行醛基-氨基反應(yīng)最終生成類黑精,類黑精具有抗氧化等活性。4 h后有所下降,可能是長時(shí)間加熱后導(dǎo)致還原性物質(zhì)分解所致[12]。江連洲等[13]研究葡聚糖糖基化處理對(duì)綠豆蛋白抗氧化性影響時(shí),發(fā)現(xiàn)反應(yīng)開始時(shí)羥自由基清除能力迅速提升,之后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。趙晶等[14]發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的延長,酪蛋白酶解物與還原糖糖基化產(chǎn)物的還原力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。兩者研究結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述,反應(yīng)時(shí)間4 h時(shí),3種糖與酪蛋白酶解物的糖基化產(chǎn)物的羥基自由基清除率和還原能力最優(yōu)。

    表5時(shí)間對(duì)不同還原糖糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率的影響

    Table5Effectsoftimeonhydroxylradicalscavengingrateofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts %

    時(shí)間/h葡萄糖木糖果糖221.87±1.20b25.63±4.29c27.47±1.54b333.20±2.65ab59.60±2.93a54.60±36.47ab442.00±14.89a66.57±4.58a83.33±1.06a525.03±3.23b38.00±9.37b28.80±4.39b

    ? 對(duì)照樣品對(duì)羥基自由基清除率為(29.02±1.57)%;同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    表6時(shí)間對(duì)不同還原糖糖基化產(chǎn)物還原能力的影響?

    Table6Effectsoftimeonthereducingpowerofdifferentreducingsugarsglycosylationproducts

    時(shí)間/h葡萄糖木糖果糖20.80±0.16b0.83±0.19b0.90±0.13ab30.78±0.14b0.88±0.11b0.83±0.19b41.05±0.15a1.12±0.05a1.14±0.19a50.55±0.02b0.70±0.05b0.64±0.04b

    ? 對(duì)照樣品還原力0.63±0.03;同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

    2.4 糖基化改性工藝的優(yōu)化

    Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白分離物與6種糖(葡萄糖、乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖)進(jìn)行美拉德反應(yīng)后,乳清蛋白分離物與木糖產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物抗氧化活性最高,其研究結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果一致。所以正交試驗(yàn)選用木糖與酪蛋白酶解物進(jìn)行糖基化反應(yīng)。正交試驗(yàn)因素水平取值見表7,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表8。

    由表8可知:影響糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率的主次因素為C>B>A。影響糖基化產(chǎn)物還原力的主次因素為B>C>A。酪蛋白酶解產(chǎn)物與木糖反應(yīng)產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率和還原能力的優(yōu)化水平分別為A2B3C2和A2B2C2。

    分別在溫度130 ℃、pH 7.5、時(shí)間4 h(A2B3C2)和溫度130 ℃、pH 7.0、時(shí)間4 h(A2B2C2)的條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,A2B3C2的羥基自由基清除率為82%,還原率為1.489;A2B2C2的羥基自由基清除率為71%,還原率為1.340。因此,確定抗氧化活性最強(qiáng)的反應(yīng)條件為A2B3C2,即溫度130 ℃、pH 7.5、時(shí)間4 h。

    3 結(jié)論

    研究結(jié)果表明,通過糖基化改性可以提高酪蛋白酶解物的抗氧化性;酪蛋白酶解產(chǎn)物與木糖糖基化改性產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng),最優(yōu)的抗氧化反應(yīng)條件為溫度130 ℃、pH 7.5、時(shí)間4 h。試驗(yàn)所涉及到的單糖種類較少,未來還可以利用其他糖類,例如半乳糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、纖維素等進(jìn)行深入研究,從而將酪蛋白水解物的抗氧化性提高,充分發(fā)揮酪蛋白水解物的抗氧化性在各類食品中的作用。

    表7 正交試驗(yàn)因素水平表

    表8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析表

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