利用基因組編輯技術(shù)治療唐氏綜合征探索性研究進(jìn)展

楊茹清 習(xí)海濤 谷峰 趙軍招

唐氏綜合征（Down syndrome，DS）是最常見(jiàn)的染色體疾病之一，其嚴(yán)重危害人類身體健康，并帶來(lái)沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DS至今仍缺乏有效的臨床治療方法，目前主要通過(guò)產(chǎn)前篩查和有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷降低DS患兒的出生率。本文主要從染色體水平出發(fā)，就利用基因組編輯技術(shù)治療DS的探索性研究進(jìn)展作一綜述。

1 DS的現(xiàn)況

DS在1866年首次由Dr.John Langdon Down提出，大量資料顯示，其臨床癥狀涉及多個(gè)器官系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為明顯的智能障礙、特殊面容、生長(zhǎng)發(fā)育障礙、多發(fā)畸形以及生活自理能力極度低下等，常伴先天性心臟病，＞50歲的患者多數(shù)患有阿爾茨海默病，并且白血病的發(fā)病率也較高[1-2]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，美國(guó)和歐洲的活產(chǎn)DS患兒出生率分別為1/691和1/1 000[3]。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，預(yù)產(chǎn)年齡＞30歲的孕婦DS發(fā)病率呈指數(shù)性增高，到45歲時(shí)其DS發(fā)病率高達(dá)1/30，因此推斷DS發(fā)病率與女性生育年齡密切相關(guān)[4]。近年，隨著我國(guó)二孩政策的實(shí)施，具有生育需求的高齡女性激增，但大多需通過(guò)體外受精-胚胎移植（IVF-ET，又稱試管嬰兒技術(shù)）實(shí)現(xiàn)妊娠[5]。Frishman等[6]對(duì)其生殖中心69例行IVF受孕（單胚移植）的患者在孕15～20周進(jìn)行產(chǎn)前篩查，發(fā)現(xiàn)試管嬰兒的DS陽(yáng)性率是普通人群的兩倍。

2 DS目前診療方法和致病機(jī)制

2.1 臨床DS患兒篩查方式 臨床上對(duì)預(yù)產(chǎn)年齡＜35歲的孕婦（除外直接行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的對(duì)象），主要采取產(chǎn)前篩查。早孕期（孕10耀14周）篩查主要是通過(guò)母血清學(xué)檢測(cè)，主要包括游離茁-人絨毛膜促性腺激素（茁-hCG）和妊娠相關(guān)血漿蛋白-A2（PAPP-A2）[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)多中心聯(lián)合對(duì)入選的75 821例單胎妊娠患者（孕11耀13周+6）輔以超聲檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可降低2%耀3%的假陽(yáng)性率[8]。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal tests，NIPT）作為近年快速興起的產(chǎn)前篩查新技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高和靈敏度高、假陽(yáng)性率低等優(yōu)勢(shì)，大多應(yīng)用于高風(fēng)險(xiǎn)DS的孕婦，同時(shí)也適用于預(yù)產(chǎn)年齡＜35歲的孕婦[9-11]。但由于其仍存在假陽(yáng)性率，且檢測(cè)成本比較高，故至今未能完全替代有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷[12]。存在預(yù)產(chǎn)年齡＞35歲或夫妻一方攜帶染色體異常等高危因素時(shí)，仍需采取有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，這是診斷DS的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。但這是一種侵襲性診斷方法，未能被大眾所廣泛接受。

2.2 針對(duì)DS患者的治療方法 臨床上目前尚無(wú)理想的治療方法，只能在疾病各階段根據(jù)DS患者不同臨床表現(xiàn)進(jìn)行對(duì)癥治療。例如治療DS相關(guān)性癡呆可用卡巴拉汀或多奈哌齊等，但不能達(dá)到有效緩解且具有明顯的不良反應(yīng)[13]。有研究嘗試使用Hedgehog激動(dòng)劑（sonic hedgehog pathway agonist，SAG）在 Ts65Dn鼠（DS最具代表性的動(dòng)物模型）上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可改善N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NM原DA）突觸可塑性和提高NMDA/琢-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體敏感性，促進(jìn)小鼠小腦形態(tài)恢復(fù)，明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶力，但尚未在臨床上普及[14]。

2.3 DS致病機(jī)制 DS主要是21號(hào)染色體異常所致，由于染色體劑量效應(yīng)使部分基因異常表達(dá)，從而產(chǎn)生臨床表型。21號(hào)染色體上約有350個(gè)基因，但與DS病理表型相關(guān)的基因主要集中在21號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，約有50個(gè)區(qū)域內(nèi)的基因與DS病理表現(xiàn)相關(guān)，該區(qū)域稱為“DS關(guān)鍵區(qū)域（Down syndrome critical region，DSCR）”[15]。RUNX1是DS神經(jīng)祖細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，位于DSCR內(nèi)，其下調(diào)可引起與其密切相關(guān)基因的表達(dá)水平改變，如 IGFBP5、CCL2、LGR5、FBLN5 和 TLR4，尤其是CCL2[16]。RUNX1基因也可通過(guò)使GATA1s基因過(guò)表達(dá)，促使DS疾病的發(fā)生[17]。

3 新型基因療法

染色體病的治療至今難以攻克，未能達(dá)到有效治愈或緩解。隨著基因編輯技術(shù)的崛起，研究者開(kāi)始嘗試通過(guò)將其致病基因失活或刪除額外21號(hào)染色體來(lái)達(dá)到治療DS的目的。

3.1 抗生素抗性基因篩選 Li等[18]于2012年在21號(hào)染色體APP基因位點(diǎn)上引入TK基因，之后通過(guò)更昔洛韋（ganciclovir，GCV）篩選，成功篩選出帶有TK基因的DS-多能干細(xì)胞（Down syndrome-induced pluripotent stem cells，DS-iPSC），使TK在GCV作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而破壞該染色體，為臨床和基礎(chǔ)研究提供新的方向，但是TK基因易突變，很容易產(chǎn)生假陽(yáng)性和脫靶的發(fā)生，且篩選陽(yáng)性率低，約為10原4。

3.2 21號(hào)染色體沉默 Jiang等[19]于2013年提出了一個(gè)新的方法，通過(guò)鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）將Xist基因插入至DS-iPSCs的21號(hào)染色體Dyrk1a位點(diǎn)。Xist基因可引起大范圍染色體表達(dá)沉默，最終致21號(hào)染色體丟失。Xist靶向準(zhǔn)確性高達(dá)98.5%，能導(dǎo)致21號(hào)染色體基因表達(dá)受抑制，但可對(duì)整個(gè)基因表達(dá)譜產(chǎn)生影響。2017年，Borensztein等[20]也嘗試將非編碼Xist基因?qū)胄∈笾踩肭按菩耘咛サ母冈葱訶染色體上，并發(fā)現(xiàn)Xist基因也可誘導(dǎo)X染色體失活。但有研究認(rèn)為此方法不能用于大片段缺失或重復(fù)的染色體，也不能完全抑制額外染色體基因的表達(dá)，因可致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陰性[21]。

3.3 基因編輯21號(hào)染色體 有研究者在2014年誘導(dǎo)環(huán)狀染色體的形成，在異常染色體長(zhǎng)短臂末端分別插入Loxp，在Cre重組酶介導(dǎo)下形成環(huán)狀染色體，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中可出現(xiàn)靶向染色體丟失，但此方法仍存在一定局限性，尤其在編輯效率上[22]。在2017年，Zuo等[23]通過(guò)CRISPR/Cas9-SgRNA靶向染色體上的重復(fù)序列（即一條染色體上有多個(gè)靶向剪切位點(diǎn)）對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞進(jìn)行染色體編輯，成功將染色體刪除。這種多位點(diǎn)剪切可通過(guò)單個(gè)sgRNA靶向結(jié)合多個(gè)特異的染色體位點(diǎn)，或者通過(guò)多個(gè)sgRNA分別結(jié)合各自的特異位點(diǎn)消除特定染色體。通過(guò)以上方式，成功將小鼠中多余的X、Y染色體敲除，也能將DS-iPSCs的21號(hào)染色體刪除。但此研究的脫靶率問(wèn)題和適用性仍待商榷，且未在人的胚胎干細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證（CRISPR/Cas9在人胚胎干細(xì)胞的編輯效率較其他類型細(xì)胞明顯低）。除此之外，此項(xiàng)研究在如何大量引入多個(gè)重復(fù)序列進(jìn)行DNA切割，如何預(yù)測(cè)這些重復(fù)序列的切割效率上仍存在局限性。但也有研究認(rèn)為，與ZFNs、轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)核酸酶（transcription acti原vator-like effector nucleases，TALENs） 相比，CRISPR/Cas9具有操作簡(jiǎn)單便捷，費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)[24-25]。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成熟，可嘗試將CRISPR/Cas9和Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)結(jié)合，使其在雙重作用下形成環(huán)狀染色體，通過(guò)傳代培養(yǎng)多代后，致環(huán)狀染色體丟失，最終使三倍體細(xì)胞恢復(fù)至二倍體細(xì)胞狀態(tài)，但目前此方法仍未得到證實(shí)。因考慮到若設(shè)計(jì)在外顯子區(qū)域，同時(shí)作用三條21號(hào)染色體，對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀察，故嘗試選擇基因的內(nèi)含子區(qū)域序列設(shè)計(jì)SgRNA。采用SgRNA專業(yè)設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）進(jìn)行設(shè)計(jì)，SaCas9設(shè)計(jì)原則為SgRNA長(zhǎng)21bp，PAM序列為NNGRRT，根據(jù)網(wǎng)站候選結(jié)果選擇預(yù)測(cè)脫靶率低的SgRNA。經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站UCSC Blast（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）檢測(cè)，確定具有較好特異性的sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，由于CRISPR系統(tǒng)作用靶位點(diǎn)后會(huì)使DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand break，DSB），在無(wú)修復(fù)模板引入的情況下，DNA可通過(guò)非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）進(jìn)行自我修復(fù)[26]?？赏ㄟ^(guò)分析Spacer區(qū)域套峰情況來(lái)評(píng)價(jià)不同CRISPR/SaCas9-SgRNA活性的高低，從而篩選出相對(duì)切割效率高的SgRNA，并用T7E1方法對(duì)篩選出來(lái)的SgRNA進(jìn)行驗(yàn)證，之后將篩選出的高效CRISPR/SaCas9-SgRNA靶向21號(hào)染色體特定位點(diǎn)，使對(duì)應(yīng)的著絲粒缺失從而刪除 21 號(hào)染色體（圖 1）[27原28]。目前單用 CRISPR/Cas9 基因編輯的效率仍較低，特別是CRISPR/Cas9脫靶問(wèn)題將阻礙新型基因組編輯的應(yīng)用[29]。故結(jié)合兩種系統(tǒng)使染色體發(fā)生臂間重組從而去除對(duì)應(yīng)的著絲粒，通過(guò)傳代培養(yǎng)多代后，致額外染色體丟失（圖2）[30]。為了能夠引入多個(gè)SgRNA進(jìn)行DNA切割，也有學(xué)者提出采用CRISPR/Cas9-腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）來(lái)增加細(xì)胞感染效率從而提高編輯效率和降低脫靶率，因?yàn)锳AV可以高保真和對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的特點(diǎn)對(duì)人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯[31]。通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染環(huán)境，CRISPR/SaCas9-AAV可針對(duì)同源性的靶序列，降低脫靶問(wèn)題[30]。盡管近年基因編輯技術(shù)已得到很大的改進(jìn)和提升，但如何選擇性地去除靶向兩條或三條同源染色體中的特定一條染色體（父或母源性染色體），目前仍無(wú)有效的應(yīng)對(duì)措施。

圖1 高效CRISPR/Cas9編輯步驟（a：高效CRISPR/Cas9-SgRNA編輯方法的過(guò)程；b：T7E1方法驗(yàn)證或進(jìn)一步篩選高效SgRNA）

圖2 高效CRISPR/SaCas9-SgRNA和Cre重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的Cre/LoxP編輯過(guò)程

我國(guó)人口基數(shù)龐大，有資料顯示DS患兒家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)為39.00萬(wàn)元，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)達(dá)45.00萬(wàn)元[32]。面對(duì)如此高額負(fù)擔(dān)，臨床上迫切需要尋找到有效的治療方法。新型基因編輯技術(shù)為染色體及其相關(guān)性疾病的治療提供了可供借鑒的方法，有望為家庭和社會(huì)減輕負(fù)擔(dān)。但目前，基因編輯技術(shù)仍處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，其安全性尚未解決,故還存在較大的倫理問(wèn)題，不能直接應(yīng)用于臨床診治。

4 小結(jié)

總之，DS是最常見(jiàn)、危害最大的染色體疾病之一。大部分患者具有明顯的智能落后、特殊面容、生長(zhǎng)發(fā)育障礙和多發(fā)畸形，且動(dòng)作發(fā)育和性發(fā)育均延遲，一般生活無(wú)法自理。鑒于目前尚無(wú)理想的臨床治療方法，只能最大程度地降低DS患者的出生率，且DS患者癥狀未能有效被控制，因此從根本（染色體水平）上探索治療DS的新方法顯得尤為重要。目前從細(xì)胞水平利用新型分子治療方法來(lái)探索DS的治療尤為熱門(mén)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)與Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的染色體工程將為DS等染色體及其相關(guān)性疾病的基因治療奠定一定的基礎(chǔ)。但由于目前基因編輯技術(shù)在臨床試驗(yàn)中涉及倫理問(wèn)題，其安全性有待商榷，仍需在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)上不斷摸索。