云南鳳慶大葉種曬青茶茶多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

段鳳敏 張紹旺 邵維炯 高華磊 匡興貴 饒杰 保志娟

摘要：以云南鳳慶大葉種曬青毛茶為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，研究乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)曬青毛茶茶多酚提取率的影響，同時(shí)通過超氧陰離子、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力評(píng)價(jià)曬青毛茶茶多酚的抗氧化性能。結(jié)果表明，0.2g茶粉在固定超聲波功率為160W下，預(yù)測(cè)最佳提取工藝為：乙醇濃度60.01%，液料比49.28：1mL/g，超聲時(shí)間25min，超聲溫度30℃，總多酚得率為19.905%（驗(yàn)證值為19.83%）。云南大葉種曬青毛茶茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)超氧陰離子、羥基自由基、DPPH自由基清除的ICso值分別為7.96μg/mL、7.22μg/mL、0.433μg/mL。

關(guān)鍵詞：大葉種;曬青毛茶;茶多酚;響應(yīng)面分析;抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2019）05-0066-08

收稿日期：2018-12-14;收到修改稿日期：2019-01-25

基金項(xiàng)目：國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017QK191）;云南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2018-180）

作者簡介：段鳳敏（1978-），女，云南鳳慶縣人，高級(jí)工程師，碩士，從事化學(xué)計(jì)量及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究。

通信作者：保志娟（1978-），女，云南曲靖市人，副教授，博士，主要從事標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制與化學(xué)計(jì)量方面的研究。

0 引言

由于得天獨(dú)厚的自然氣候條件，云南擁有豐富的茶樹種質(zhì)資源。大葉種茶樹是山茶科山茶，屬山茶種（Camellia sinensis），是在云南特殊生態(tài)環(huán)境條件下生長繁衍的具有自身獨(dú)特個(gè)性的栽培品種，分為喬木、小喬木等類型[1]。云南大葉種茶主要包括勐庫大葉種、鳳慶大葉種和勐海大葉種等?！傍P慶大葉種”，以云南省臨滄市鳳慶縣為中心，主要分布在滇西與滇南茶區(qū)。云南大葉種茶葉含有豐富的茶多酚、咖啡堿等功能成分[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，是兒茶素類（黃烷醇類）、黃酮及黃酮醇類、花青素類、酚酸及縮酚酸類、聚合酚類等化合物的復(fù)合體[3]。茶多酚中黃烷醇（兒茶素）類化合物是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一[1]。近年研究表明，茶多酚等活性物質(zhì)還具有解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓，被健康及醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“輻射克星”和“天然抗氧化劑”，在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[4]。如何提取測(cè)定茶多酚已成為食品和茶葉科學(xué)研究的熱點(diǎn)[5-6]。

超聲波輔助提取茶多酚具有時(shí)間短、效率高的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合響應(yīng)面分析可以獲得最佳的提取工藝，已成為茶多酚提取的有效方法之一[7-10]。目前，云南鳳慶大葉種茶中對(duì)茶多酚的提取研究較少。因?yàn)椴瓒喾釉跇O性溶劑中具有優(yōu)良的溶解性，目前浸提茶多酚多采用水、乙醇等極性溶劑[11]，研究表明乙醇提取比水提取茶多酚時(shí)間更短[4]。因此，本研究以云南臨滄產(chǎn)的鳳慶大葉種曬青毛茶為原料，采用超聲波輔助提取法，以乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度為考察因素，研究了不同提取工藝參數(shù)對(duì)茶多酚提取率的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件，并對(duì)最佳工藝下得到的茶多酚提取物進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，以期為云南鳳慶大葉種曬青毛茶的開發(fā)和抗氧化劑資源篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

市購云南臨滄產(chǎn)鳳慶大葉種曬青毛茶（秋茶），于40℃烘箱內(nèi)干燥2～3h，用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，密封避光保存。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）購于上海源葉生物科技有限公司。沒食子酸，福林酚試劑、碳酸鈉、乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)：WFJ200，尤尼柯（上海）儀器有限公司;電子天平：AR224CN（精確到0.1mg），奧豪斯儀器（常州）有限公司;超聲波清洗機(jī)：臺(tái)式數(shù)控KQ5200DE（超聲頻率40kHz，最大超聲功率200W），浙江昆山超聲清洗儀器有限公司;臺(tái)式離心機(jī)：TDL-5013，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

用移液管分別移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL質(zhì)量濃度為1mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻配成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別移取系列沒食子酸工作液各1.0ML于刻度試管內(nèi)，在每個(gè)試管內(nèi)分別加入5.0mL的10%福林酚試劑，搖勻。反應(yīng)5mim，加入4.0mL7.5%NaCO，溶液，加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60min，測(cè)定765nm波長下的吸光度。根據(jù)沒食子酸工作液的吸光度與濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 茶多酚提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取粉碎后的茶葉粉末樣品0.2g于試管中，加入一定量的乙醇溶液，在超聲波清洗器中，固定超聲功率為160W，在一定的超聲溫度條件下，處理一定的超聲時(shí)間，離心，吸取上清液于100ML的容量瓶中，用水定容為樣品母液。準(zhǔn)確移取樣品母液1.0mL正于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻得到樣品待測(cè)液。取1.0mL待測(cè)液按照上述

1.3.1 測(cè)定方法加入10%福林酚試劑和7.5%NaCO₃溶液，測(cè)定765皿波長下的吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出茶多酚的提取率，計(jì)算公式為：

茶多酚提取率=ρ×X×V/m×100%式中：ρ——溶液中茶多酚質(zhì)量濃度，mg/mL;

X——稀釋倍數(shù);

V——濾液體積，mL;

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 茶多酚單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.2g茶葉，分別考察了乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化茶多酚提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)自變量，以茶多酚提取率為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值，優(yōu)化云南鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚提取工藝條件。響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

1.3.5 茶多酚提取液抗氧化活性實(shí)驗(yàn)[12-14]

1）超氧陰離子清除活性測(cè)定

在總體積為5mL的溶液中加入4mL Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液及不同體積的待測(cè)樣品，定容為5mL，于25℃恒溫水浴放置20min。加入0.2mL預(yù)熱過的鄰苯三酚（10mmol/L，溶于10mmol/L鹽酸中）引發(fā)反應(yīng)，準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，加入60μL0.1mol/L的抗壞血酸水溶液終止反應(yīng)，以相應(yīng)的抗壞血酸水溶液為空白，于1h內(nèi)測(cè)定420mm波長下的吸光度A。其抑制率計(jì)算公式為：

抑制率%=[1-（A₃-A₄）]/A₁-A₂×100%式中：A₁——不含樣品的吸光度值;

A₂——不含樣品和鄰苯三酚的吸光度值;

A₃——含有樣品的吸光度值;

Ax±s——含樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度值。

2）羥基自由基清除活性測(cè)定

分別向5支試管中加入1mL 8.8mmol/L FeSO₄、1mL 9.1mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1ML不同濃度茶多酚提取樣品液和5mL蒸餾水，再加入1ML0.06%H₂O₂啟動(dòng)反應(yīng)，立即放入37℃水浴鍋中保溫30min后，以蒸餾水為參比，測(cè)定510mn波長下的吸光度值，記為Al。用1ML的蒸餾水代替1ML的H₂O₂，按上述同樣的方法測(cè)定吸光度值，記錄為A₂。用1ML蒸餾水代替1ML樣品，按上述同樣的方法測(cè)定吸光度值，記錄為A₃。

羥基由基抑制率/%[A₃-（A₁-A₂）]/A₃×100%

3）DPPH自由基清除活性測(cè)定

配制濃度為2.0×10^-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液。取2.0mL DPPH溶液，加入不同體積的茶多酚提取樣品溶液，用水定容為5mL，放置30min后，測(cè)定吸光度。

抑制率%=（A₀-A_i）/A₀×100%式中：A₀——2.0mL DPPH溶液定容為5mL時(shí)的吸

光度;

A_i——2.0mL DPPH溶液加入樣品溶液后，定容為5n止時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的影響

準(zhǔn)確取0.2g茶葉，配置乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，在液料比50：1mL/g，超聲溫度40℃，超聲20min的條件下進(jìn)行樣品提取，考察乙醇濃度對(duì)茶多酚提取率的影響，每個(gè)條件平行3次，不同乙醇濃度對(duì)茶多酚提取率的影響如圖1所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，茶多酚提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在70%處達(dá)到最大值。因此實(shí)驗(yàn)選定60%、70%、80%乙醇體積分?jǐn)?shù)為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的三個(gè)水平。

2.1.2 液料比的影響

準(zhǔn)確取0.2g茶葉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲溫度40℃、超聲20min的條件下進(jìn)行樣品提取，考察不同液料比（20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1mL/g）對(duì)茶多酚提取率的影響。不同的液料比對(duì)茶多酚提取率的影響如圖2所示，當(dāng)液料比為20：1（mL/g）到40：1（mL/g）時(shí)，提取率隨著液料比的加大，有持續(xù)上升的趨勢(shì)，在液料比40：1（mL/g）時(shí)，含量達(dá)到最高，這是因?yàn)橐毫媳仍龃笤谝欢ǔ潭壬咸岣吡藗髻|(zhì)推動(dòng)力。但是在液料比大于50：1（mL/g）后，茶多酚提取率變化較小，表明此后物質(zhì)不再溶出。由于液料比過大會(huì)造成浪費(fèi)，故試驗(yàn)以40：1（mL/g）為最佳液料比，選定30：1、40：1，50：1（mL/g）液料比為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.3 超聲溫度的影響

準(zhǔn)確取0.2g茶葉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比50：1（mL/g）、超聲20min，考察不同的超聲溫度（30，40，50，60，70℃）對(duì)茶多酚提取率的影響。不同的超聲溫度對(duì)茶多酚提取率的影響如圖3所示，當(dāng)溫度為30～50℃時(shí)，隨著溫度上升，提取率不斷增加，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，提取率最高，為16.55%，當(dāng)溫度超過40℃后，提取率隨著溫度的增加反而有所下降，但是當(dāng)溫度為60℃時(shí)，茶多酚含量再次升高，達(dá)到16.43%，在提取溫度為30～70℃時(shí)，出現(xiàn)了兩個(gè)最佳提取溫度，分別為40℃和60℃，溫度過高，會(huì)造成溶劑揮發(fā)損失，因此試驗(yàn)以40℃為最佳提取溫度，選定30℃、40℃、50℃的提取溫度為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.4 超聲時(shí)間的影響

準(zhǔn)確取0.2g茶葉，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，液料比50：1（mL/g），超聲溫度40℃，考察不同的超聲時(shí)間（5，10，15，20，25，30，35min）對(duì)茶多酚提取率的影響。不同的超聲時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響如圖4所示，隨著超聲提取時(shí)間的增加，茶多酚提取率呈現(xiàn)緩慢增加達(dá)到最高點(diǎn)再下降的趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間到達(dá)30min時(shí)，提取率最高，為16.68%，當(dāng)時(shí)間超過30min，提取率略有下降，因此試驗(yàn)以30min為最佳超聲提取時(shí)間，選定超聲提取時(shí)間為25，30，35min試驗(yàn)因素水平。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，優(yōu)化茶多酚的提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度4個(gè)自變量的實(shí)驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以茶多酚提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平的二次回歸旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)，共有29組試驗(yàn)，其中24個(gè)試驗(yàn)為分析因子，5次試驗(yàn)為零點(diǎn)，不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用軟件對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得茶多酚提取率（Y）對(duì)自變量乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）的二次多元回歸模型方程：Y=18.12+0.030A+0.39B-0.071C-0.29D-0.27AB+0.29AC+0.044AD+0.35BC+0.23BD+0.19CD-0.087A²+0.12B²+0.16C²+0.68D²

回歸方程的方差分析數(shù)據(jù)見表3，回歸模型差異極顯著（P<0.0001），失擬檢驗(yàn)值不顯著（P=0.3803>0.05），說明模型可以擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬合度良好。決定系數(shù)（r²）0.9446和調(diào)整后決定系數(shù)（r_ADJ²）0.8893，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性;CV值為0.98%，說明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，具有可重復(fù)性。

回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示：模型中一次項(xiàng)（B和D）和二次項(xiàng)（D²）（P<0.0001）差異極顯著;交互項(xiàng)（AB、AC、BC）（P<0.01）差異較顯著;交互項(xiàng)（BD）和二次項(xiàng)（C²）（P<0.05）差異顯著。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述，圖5直觀反映了乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度的響應(yīng)曲面的形狀對(duì)茶多酚提取率的影響。圖5（a、b、c）及（b、d、e）分別為乙醇濃度、超聲時(shí)間與其他3個(gè)因素交互作用對(duì)茶多酚提取率的影響。乙醇濃度、超聲時(shí)間對(duì)茶多酚的提取率來說并不顯著。圖5（a、d、f）為料液比與其他3個(gè)因素對(duì)茶多酚提取率的影響。從圖中可以看出，相比其他因素，料液比對(duì)茶多酚的提取率的影響更為顯著，隨著料液比的增加，茶多酚提取率增加。圖5（c、e、f）為超聲溫度與其他3個(gè)因素對(duì)茶多酚提取率的影響。因?yàn)闇囟仍黾樱谷軇┑恼扯冉档?，加快了介質(zhì)傳遞，從而導(dǎo)致茶多酚提取率隨溫度的升高明顯增大。各因素對(duì)茶多酚提取率的影響的大小順序?yàn)椋阂毫媳龋˙）>超聲溫度（D）>超聲時(shí)間（C）>乙醇濃度（A）。另外，從圖5中的a、b、d的圖形可以看出，乙醇濃度與料液比，乙醇濃度與超聲時(shí)間，料液比與超聲時(shí)間的交互作用較顯著，這與回歸分析相一致。

2.2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design-Expert.V8.0.6軟件回歸模型分析，得出的茶多酚的最佳提取條件是：乙醇濃度60.01%、液料比49.28：1（mL/g），超聲時(shí)間25min，超聲溫度30℃，在此條件下模型預(yù)測(cè)的最大提取率為19.905%?？紤]到試驗(yàn)條件的可操作性，將提取工藝的參數(shù)調(diào)整為：乙醇濃度60%，液料比50：1（mL/g），超聲時(shí)間25min，超聲溫度30℃，在此條件下做八次驗(yàn)證試驗(yàn)，茶多酚提取率為19.83%、與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差0.38%<5%，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際提取量，具有較好的可行性和實(shí)用價(jià)值。

2.3 茶多酚體外抗氧化活性的測(cè)定

利用上述最優(yōu)提取工藝對(duì)云南鳳慶大葉種曬青毛茶中的茶多酚進(jìn)行提取，試驗(yàn)分別測(cè)定了茶多酚提取物對(duì)超氧陰離子（O₂^-）、羥基自由基（·OH）和DPPH自由基（DPPH·）的抑制率IC₅₀值。

2.3.1 茶多酚提取液清除超氧陰離子（O₂^-）的測(cè)定

鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚提取液對(duì)超氧陰離子（O₂^-）的清除作用由圖6所示。從圖中可以看出，在0～11μg/mL濃度范圍內(nèi)，曬青毛茶中茶多酚對(duì)超氧陰離子（O₂^-）的清除率隨著濃度增加而逐漸升高，但當(dāng)?shù)竭_(dá)sμg/mL時(shí)，超氧陰離子（OZ）的清除率隨茶多酚濃度的增加而趨于平緩。茶多酚清除超氧陰離子（O₂^-）的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）約為7.96μg/mL。

2.3.2 茶多酚提取液清除羥基自由基（·OH）的測(cè)定

鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚提取液對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用由圖7所示。從圖中可以看出，在0～5μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著曬青毛茶中茶多酚濃度的增加，茶多酚對(duì)羥基自由基（·OH）的清除率隨濃度增加而逐漸升高。茶多酚清除羥基自由基（·OH）的ICsa計(jì)算為7.22μg/mL。

2.3.3 茶多酚提取液清除DPPH自由基（DPPH·的測(cè)定

DPPH的乙醇溶液為深紫色，最大吸收波長為517mm，當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，DPPH的溶液將會(huì)褪色。鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚對(duì)DPPH自由基（DPPH·）的清除作用由圖8所示。從圖中可以看出，較低的茶多酚濃度對(duì)DPPH自由基（DPPH·）就有較高的清除率，但當(dāng)濃度到達(dá)1.2μg/mL時(shí)，DPPH自由基（DPPH·）的清除率曲線變化趨于平緩。茶多酚清除DPPH自由基（DPPH·）的IC₅₀計(jì)算為0.433μg/mL。

3 結(jié)束語

1）利用超聲波輔助提取了云南臨滄產(chǎn)鳳慶大葉種曬青毛茶中的茶多酚，研究了乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)提取率的影響。利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了曬青毛茶中茶多酚提取的最佳工藝條件（固定超聲波功率160W）為：乙醇濃度60.01%，液料比49.28：1，超聲時(shí)間25min，超聲溫度30℃。在此條件下茶多酚的提取率為19.83%，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差僅為0.38%，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)工藝條件可靠。

2）經(jīng)過3種體外抗氧化指標(biāo)試驗(yàn)，表明云南臨滄產(chǎn)鳳慶大葉種曬青毛茶中的茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化性，其清除超氧陰離子（O₂^-），羥基自由基（·OH）和DPPH自由基（DPPH·）IC₅₀值分別為7.96μg/mL，7.22μg/mL，0.433μg/mL。

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（編輯：徐柳）