補(bǔ)髓生血顆粒對(duì)慢性再生障礙性貧血患者骨髓VLA-4和VLA-5mRNA表達(dá)的影響

王金環(huán)， 李鶴然， 郝晶， 欒仲秋， 孫鳳， 趙偉，王小東， 田飛， 孫岸弢， 孫偉正

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100700）

慢性再生障礙性貧血（chronic aplastic anemia，CAA），屬于原發(fā)性骨髓造血衰竭性貧血的一種，其主要表現(xiàn)是紅髓衰竭和骨髓小?？仗摚载氀?、出血、感染為主要臨床表現(xiàn)[1]。中醫(yī)將其稱為“髓勞病”，病位在骨髓。其病機(jī)為“腎虛髓枯為本，脾虛氣血不足為標(biāo)”，治療則以補(bǔ)益為原則，以補(bǔ)腎填精為基本大法。我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，進(jìn)一步探討補(bǔ)腎生血中藥治療CAA的療效機(jī)理和作用機(jī)制，觀察補(bǔ)髓生血顆粒對(duì)CAA患者骨髓極遲活化抗原4（very late antigen-4，VLA-4）和極遲活化抗原5（very lateantigen-5，VLA-5）mRNA表達(dá)的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年11月至2016年10月期間黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病科門診及住院部所收集的30例CAA腎陰陽(yáng)兩虛型患者為試驗(yàn)組，其中男18例，女12例。另招募10例無血液疾病及免疫系統(tǒng)疾病的健康志愿者為正常對(duì)照組。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照張之南主編的第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]中CAA的診斷標(biāo)準(zhǔn)和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3]中慢性髓勞病的中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)證型為腎陰陽(yáng)兩虛型。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合CAA的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和慢性髓勞病的中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)證型為腎陰陽(yáng)兩虛型；②發(fā)病后未經(jīng)西醫(yī)治療或經(jīng)過治療6個(gè)月以上無效者；③年齡大于22歲且小于56歲；④同意參加本研究，簽署知情同意書，并有良好依從性的患者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①妊娠期及哺乳期婦女；②患有引起全血細(xì)胞減少的其他疾病患者；③對(duì)試驗(yàn)藥物成分過敏的患者；④精神性疾病患者；⑤合并有嚴(yán)重心、腦、肝、腎疾病患者；⑥依從性差，未按規(guī)定服藥，療程不足6個(gè)月的患者。

1.5 治療方法 試驗(yàn)組患者給予補(bǔ)髓生血顆粒治療。用法：入選患者均于入組前2周停服其他治療CAA的藥物，2周后開始服用補(bǔ)髓生血顆粒（為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要由人參、熟地黃、鹿茸、白花蛇舌草、山茱萸、巴戟天、豬苓、淫羊藿等藥物組成），每日3次，每次1袋，連續(xù)服用6個(gè)月。

1.6 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（PT-PCR）法檢測(cè)CAA患者治療前后骨髓VLA-4和VLA-5mRNA表達(dá)水平的變化情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較釆用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-4mRNA表達(dá)水平比較 表1和圖1結(jié)果顯示：治療前，試驗(yàn)組患者骨髓VLA-4mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，試驗(yàn)組患者VLA-4mRNA表達(dá)水平較治療前有一定程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但仍未恢復(fù)到正常對(duì)照組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-4m RNA表達(dá)水平比較Table 1 Com parison of VLA-4m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

表1 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-4m RNA表達(dá)水平比較Table 1 Com parison of VLA-4m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

①P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，與治療前比較

組別N VLA-4mRNA治療前 治療后試驗(yàn)組正常對(duì)照組30 10 23.61±1.73①45.39±1.27 38.29±2.01①②

圖1 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-4m RNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較Figure 1 Comparison of VLA-4mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatmentw ith normalcontrolgroup

2.2 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-5mRNA表達(dá)水平比較 表2和圖2結(jié)果顯示：治療前，試驗(yàn)組患者VLA-5 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，試驗(yàn)組患者VLA-5mRNA表達(dá)水平較治療前有一定程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但仍未恢復(fù)到正常對(duì)照組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-5m RNA表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of VLA-5mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

表2 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-5m RNA表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of VLA-5mRNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatment（）

①P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，與治療前比較

組別N VLA-5mRNA治療前 治療后試驗(yàn)組正常對(duì)照組30 10 24.85±3.24①8.02±3.20 16.32±3.19①②

圖2 試驗(yàn)組患者治療前后骨髓VLA-5m RNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較Figure 2 Com parison of VLA-5m RNA expression level in the bonemarrow of the trialgroup before and after treatmentw ith normalcontrolgroup

3 討論

補(bǔ)髓生血顆粒歷經(jīng)50多年的臨床研究與實(shí)踐，療效確切。筆者在過去的臨床實(shí)踐中，通過觀察205例慢性再生障礙性貧血（CAA）患者，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)髓生血顆粒治療陰虛型CAA患者的有效率為68.00%，治療陽(yáng)虛患者的有效率為89.25%[4]；張守琳等[5]對(duì)32例CAA患者進(jìn)行臨床觀察，應(yīng)用補(bǔ)髓生血顆粒治療后的總有效率為75.0%；李志俠[6]對(duì)30例CAA患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)髓生血顆粒治療CAA的總有效率為79.99%；劉娜等[7]對(duì)67例CAA患者展開研究，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)髓生血顆粒治療CAA療效較好，能明顯改善患者不適癥狀，提高中醫(yī)證候平均積分，改善骨髓增生程度，提高患者的血紅蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平，以上研究結(jié)果均提示了補(bǔ)髓生血顆粒治療CAA的療效顯著。

骨髓為血液的主要制造場(chǎng)所。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人始生，先成精，精成而腦髓生，骨為干，脈為營(yíng)，血乃成。髓勞病的發(fā)病主要是腎精虧虛，腎陰虧損，陰損及陽(yáng)，腎陽(yáng)不振，則骨髓無力造血，陰不制陽(yáng)，虛熱內(nèi)生，熬精耗液，陰損更甚，日久則精竭髓枯，如此往復(fù)，惡性循環(huán)。補(bǔ)髓生血顆粒對(duì)CAA的治療主要是通過補(bǔ)腎生血的方法來達(dá)到治療目的。該藥根據(jù)中醫(yī)腎藏精、精生髓、精血同源的理論，采用補(bǔ)腎填精益髓之法，滋陰壯陽(yáng)，補(bǔ)腎填精[8]。方中應(yīng)用熟地黃、山茱萸、枸杞子等滋陰補(bǔ)腎養(yǎng)血；淫羊藿、巴戟天等補(bǔ)腎益氣壯陽(yáng)，黃芪、人參大補(bǔ)元?dú)?、生精化血，丹參、雞血藤等活血化瘀、去瘀生新，白花蛇舌草、豬苓清熱解毒。在應(yīng)用補(bǔ)髓生血顆粒治療CAA的過程中，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎生血中藥可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附分子，進(jìn)而調(diào)節(jié)造血微環(huán)境，促進(jìn)骨髓造血功能的重塑。

整合素是細(xì)胞表面糖蛋白受體的主要家族[9]，是細(xì)胞識(shí)別的重要途徑。整合素在體內(nèi)表達(dá)廣泛，在生命活動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色，它能夠介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附情況，還能夠誘導(dǎo)各細(xì)胞間的相互作用。其中成員最多的為β1整合素，VLA-4和VLA-5則是β1整合素家族中激活晚期出現(xiàn)的VLA亞家族成員。VLA-4一般表達(dá)于各種淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的表面，能夠穿過相應(yīng)配體到達(dá)炎癥部位，在淋巴細(xì)胞的解析、生存、遷移、分化、歸巢等多種細(xì)胞生命活動(dòng)中起到較為關(guān)鍵的作用[10]。VLA-5能夠參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，促進(jìn)造血細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)。

CAA患者發(fā)病時(shí)VLA-4呈低表達(dá)狀態(tài)，說明VLA-4可能參與了CAA的造血微環(huán)境的發(fā)病機(jī)制[11]。VLA-4與調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞之間的黏附作用有關(guān)。有研究[12]顯示，黏附分子VLA-4能夠結(jié)合多種配體，既能介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，又能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的黏附信息，是介導(dǎo)造血干細(xì)胞與骨髓黏附能力較為重要的受體。纖維連接蛋白（FN）是骨髓基質(zhì)的主要組成成分，與VLA-4相結(jié)合可以介導(dǎo)骨髓干細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的黏附作用，使干細(xì)胞固定于骨髓中的某個(gè)位置，從而引起細(xì)胞的增殖和分化。本次研究中，治療前CAA患者骨髓黏附分子VLA-4mRNA表達(dá)低于正常對(duì)照組，經(jīng)治療6個(gè)月后，患者VLA-4 mRNA表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究結(jié)果提示，當(dāng)VLA-4mRNA呈低表達(dá)時(shí)，抑制了骨髓造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化，可能導(dǎo)致CAA的發(fā)病。補(bǔ)髓生血顆粒通過對(duì)VLA-4mRNA黏附表達(dá)功能的調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化。

VLA-5是整合素亞家族成員之一，能夠促進(jìn)造血細(xì)胞的進(jìn)一步分化。用特異性抗體、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素3（IL-3）、粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體（SCF），或蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活物處理造血細(xì)胞，可增強(qiáng)VLA-5mRNA與其他配體結(jié)合的能力。VLA-5主要作用在細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)當(dāng)中，與細(xì)胞的分化和走行息息相關(guān)。VLA-5在造血祖細(xì)胞居于骨髓過程中發(fā)揮作用，可能具有增強(qiáng)造血細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。在本次研究中，CAA患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞黏附分子VLA-5mRNA高于正常表達(dá)，有可能參與了造血調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)造血起到負(fù)調(diào)控作用，使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，從而導(dǎo)致CAA的發(fā)生。補(bǔ)髓生血顆粒通過調(diào)節(jié)VLA-5 mRNA的黏附表達(dá)功能，抑制了細(xì)胞凋亡，改善黏附功能，促進(jìn)造血，改善CAA患者貧血的狀態(tài)。

杜華等[13]報(bào)道，根據(jù)VLA-4mRNA和VLA-5 mRNA對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的影響，干細(xì)胞可迅速穿過細(xì)胞外基質(zhì)遷移至骨髓腔內(nèi)的干細(xì)胞龕附近，協(xié)助造血細(xì)胞黏附并定位于微環(huán)境中，促進(jìn)造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞聚合，完成造血干細(xì)胞的遷移和歸巢。在本次研究中，我們推測(cè)當(dāng)VLA-4mRNA發(fā)生低表達(dá)、VLA-5mRNA發(fā)生高表達(dá)時(shí)，可能使造血干細(xì)胞的功能發(fā)生改變，導(dǎo)致造血細(xì)胞的黏附功能發(fā)生異常，使其歸巢能力、瞄定微環(huán)境能力下降，導(dǎo)致造血干細(xì)胞的增殖和分化能力降低，從而致使CAA發(fā)生。應(yīng)用補(bǔ)髓生血顆粒，可能會(huì)平衡VLA-4mRNA和VLA-5mRNA黏附功能的表達(dá)，使低表達(dá)的VLA-4mRNA水平升高和高表達(dá)的VLA-5mRNA水平降低，雖未恢復(fù)至正常對(duì)照組水平，但對(duì)骨髓造血功能的改善則是顯而易見的。補(bǔ)髓生血顆?？赡芡ㄟ^促進(jìn)造血干細(xì)胞的自我復(fù)制能力，增強(qiáng)細(xì)胞增殖和分化的能力，修復(fù)和改善骨髓微環(huán)境，為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的生存環(huán)境。因此，應(yīng)用補(bǔ)髓生血顆粒治療CAA，能夠刺激造血干/祖細(xì)胞的自我復(fù)制功能和增殖分化能力[14]，改善骨髓微環(huán)境的狀態(tài)，有利于促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述，CAA患者服用補(bǔ)髓生血顆粒后骨髓VLA-4mRNA、VLA-5mRNA的表達(dá)水平有比較明顯的改善，補(bǔ)髓生血顆?？赡芡ㄟ^促進(jìn)β1整合素的某些黏附因子發(fā)揮其作用，從而改善造血微環(huán)境，達(dá)到促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞增殖和分化的治療目的。