鹽酸米那普侖片微生物限度檢查方法的適用性驗(yàn)證

瞿燕萍 吳青一

摘 要 目的：建立抗抑郁藥物鹽酸米那普侖片微生物限度檢查方法并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。方法：參照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則，采用薄膜過(guò)濾法和平皿法測(cè)定鹽酸米那普侖片對(duì)金黃色葡萄球菌等5種試驗(yàn)菌種的回收率，并對(duì)其進(jìn)行了控制菌適用性試驗(yàn)。結(jié)果：5種試驗(yàn)菌回收率均在0.5～2.0范圍，控制菌可檢出。結(jié)論：本試驗(yàn)所建立方法可用于鹽酸米那普侖片的微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞 鹽酸米那普侖 驗(yàn)證 微生物限度試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R971.43； R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）19-0076-04

Validation of the applicability of microbial limit test for minapram hydrochloride tablets

QU Yanping*， WU Qingyi

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish and verify the microbial limit test method for minapram hydrochloride tablets. Methods： According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles， the recovery rates of minapram hydrochloride tablets against 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus were measured by membrane filtration and Petri dish methods， and the applicability test of E.coli as a control bacterium was also performed. Results： The recovery rates of the 5 kinds of experimental microorganisms were in the range of 0.5-2， and the control bacterium could be detected. Conclusion： The methods established in this experiment can be used for the microbial limit test of minapram hydrochloride tablets.

KEy WORDS minapram hydrochloride； verification； microbial limit test

米那普侖是一種新型的特異性5-HT和NE再攝取抑制劑（SNRI）。這類抗抑郁劑的療效可能較SSRI更好，同時(shí)又沒(méi)有TCA那樣的不良反應(yīng)[1]。上?，F(xiàn)代制藥于2015年正式上市，鹽酸米那普侖被認(rèn)為是目前對(duì)兩種神經(jīng)遞質(zhì)重吸收抑制作用最為均衡的SNRI類藥物，對(duì)5-羥色胺和去甲腎上腺素重吸收抑制的作用最接近1∶1（雙通道的再攝取抑制作用遠(yuǎn)優(yōu)于文拉法辛1∶30和度洛西汀1∶9）[2]。鹽酸米那普侖片微生物限度檢查包括需氧菌、霉菌和酵母，控制菌選取大腸埃希菌。所以，對(duì)于此類藥物，單用稀釋和加中和劑的方法很難使試驗(yàn)菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母菌、黑曲霉）的比值都達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。為保障患者的用藥安全，確立可靠的微生物限度檢驗(yàn)方法，本試驗(yàn)參照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則1105、1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法、控制菌檢查法，對(duì)鹽酸米那普侖片微生物限度檢查方法進(jìn)行了摸索與驗(yàn)證[3]，發(fā)現(xiàn)稀釋液中加入中和劑不適用于鹽酸米那普侖片的適用性試驗(yàn)，需采用定容法取上層液加薄膜過(guò)濾法可有效地去除其有效成分對(duì)測(cè)定的干擾。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

鹽酸米那普侖片（規(guī)格25 mg，批號(hào)180601，上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司）；pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號(hào)170801，上海盛思生化科技有限公司）；蛋黃卵磷脂（批號(hào)180324，博飛美科試劑）；吐溫80（批號(hào)20131016，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基與菌種

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)分別為170801、171109、180103、161201、160701，上海盛思生化科技有限公司）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， CMCC（B）26003）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， CMCC（B）10104）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis， CMCC（B）-63501）、白色假絲酵母（Candida albicans， CMCC（F）-98001）、黑曲霉（Aspergillus niger， CMCC（F）-98003）和大腸埃希菌（Escherichia coli， CMCC（B）44102）均來(lái)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

LRH-150生化培養(yǎng)箱、GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；S20 pH酸度計(jì)（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司）； HT-600N電子天平（成都普瑞遜電子有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；1300 SERIES A2生物安全柜（賽默飛世爾科技公司）；YX940D電動(dòng)吸引器（上海醫(yī)療器械公司醫(yī)用吸引器廠）；JYD-400N均質(zhì)器（上海之信儀器有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

參照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則[3]對(duì)鹽酸米那普侖片進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)、控制菌檢查方法的確認(rèn)。

1.5 菌液的制備

參照2015年版《中國(guó)藥典》四部通則[3]1105微生物計(jì)數(shù)法項(xiàng)下方法制備菌液。革蘭陽(yáng)性菌須稀釋10-3～10-7倍，使菌落數(shù)不大于100 cfu/ml。

1.5.1 供試液的制備

1）供試液1（1∶10） 取鹽酸米那普侖片10 g，粉碎，移至一次性無(wú)菌袋中，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml中，拍打器拍打1 min（拍打速率為12/min）。

2）供試液2（1∶20） 取供試液1 100 ml，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml中，混勻，即得。

3）供試液3（1∶10） 取鹽酸米那普侖片10 g，粉碎，移至一次性無(wú)菌袋中，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（內(nèi)含0.3%卵磷脂與3%吐溫80）100 ml中，拍打器拍打1分鐘（拍打速率為12/min）。

1.5.2 計(jì)算公式及接受標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)組比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。所得比值均應(yīng)在0.5～2.0范圍內(nèi)。

1.5.3 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

1）需氧菌計(jì)數(shù)方法的確定（預(yù)試驗(yàn)） 以金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。分別采用a，b，c，d，e 5種方法對(duì)供試品進(jìn)行處理。①方法a：取1 ml供試液1（1∶10）平皿法測(cè)定；②方法b：取1 ml用定性濾紙過(guò)濾的供試液3（1∶10）平皿法測(cè)定；③方法c：取1 ml用定性濾紙過(guò)濾的供試液3（1∶10），采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過(guò)濾沖洗（最后沖洗100 ml時(shí)加入菌懸液）；④方法d：取1 ml供試液3（1∶10），采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過(guò)濾沖洗（最后沖洗100 ml時(shí)加入菌懸液）；⑤方法e：取1 ml供試液2（1∶20）上層液，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過(guò)濾沖洗（最后沖洗100 ml時(shí)加入菌懸液）。

2）方法驗(yàn)證 分別取一批供試品按方法e進(jìn)行處理，采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。①試驗(yàn)組：取供試液2（1∶20）1 ml薄膜過(guò)濾，沖洗時(shí)加入1 ml菌液（<100 cfu/ml），濾干，于胰酪大豆胨瓊脂（TSA）平板上培養(yǎng)；②供試品對(duì)照組：不加入菌液的供試液，測(cè)定供試品微生物數(shù)；③菌液對(duì)照組；取稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行回收試驗(yàn)。

1.5.4 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)驗(yàn)證

1）霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的確定（預(yù)試驗(yàn)） 以白色假絲酵母和黑曲霉菌為試驗(yàn)菌。分別采用分別采用f，g，h 3種方法對(duì)供試品進(jìn)行處理。①方法f：取1 ml供試液1（1∶10）平皿法測(cè)定；②方法g：取1ml用定性濾紙過(guò)濾的供試液3（1∶10）平皿法測(cè)定；③方法h：取1 ml供試液1（1∶10）上層液平皿法測(cè)定。

2）方法驗(yàn)證 分別取一批供試品按方法h進(jìn)行處理，采用平皿法進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。①試驗(yàn)組：取供試液1（1∶10）1 ml，立即傾注于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基平板中，培養(yǎng)；②供試品對(duì)照組：不加入菌液的供試液，測(cè)定供試品微生物數(shù)；③菌液對(duì)照組；取稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行回收試驗(yàn)。

1.5.5 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)

以大腸埃希菌作為控制菌采用平皿法進(jìn)行操作。①試驗(yàn)組：取供試液2（1∶20）20 ml，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過(guò)濾沖洗，取濾膜置100 ml TSB中，混勻，同時(shí)加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻；②陰性對(duì)照組：取TSB 100 ml，不加入樣品和菌懸液；③菌液組：取TSB 100 ml加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻。均按藥典方法培養(yǎng)，以接入試驗(yàn)組的大腸埃希菌被檢出為接受標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)

五種預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法e可用于需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

2.2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

按照方法e對(duì)一批供試品進(jìn)行平行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明采用方法e可用于鹽酸米那普侖片需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)（表2）。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)的預(yù)實(shí)驗(yàn)

三種預(yù)實(shí)驗(yàn)方法試驗(yàn)結(jié)果表明，方法h可用于霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)方法驗(yàn)證

按照方法h對(duì)一批供試品進(jìn)行平行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明采用方法f可用于鹽酸米那普侖片霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)（表4）。

2.5 控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)

控制菌選用稀釋10-6倍的大腸埃希菌，一批供試品進(jìn)行平行三次驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明，適用性試驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)（表5）。

3 討論

通過(guò)上述一系列試驗(yàn)，成功摸索出了適合鹽酸米那普侖片的微生物限度控制方法，本次驗(yàn)證試驗(yàn)中需要注意的兩點(diǎn)：①樣品在pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中溶解后需放置至上層液盡量清澈后再吸取供試液進(jìn)行試驗(yàn)；②在進(jìn)行薄膜過(guò)濾時(shí)濾膜盡量抽濾充分后進(jìn)行培養(yǎng)，防止菌落出現(xiàn)連片現(xiàn)象，從而影響計(jì)數(shù)觀察。

微生物限度檢查是判斷藥品受到微生物污染的程度，是企業(yè)從原料到成品生產(chǎn)全過(guò)程進(jìn)行微生物評(píng)價(jià)的主要依據(jù)，同時(shí)也是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目[4-6]。檢查方法中干擾因素較多，易影響計(jì)數(shù)結(jié)果，如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、加菌濃度及加菌量等[7-8]。本次驗(yàn)證中鹽酸米那普侖片是抗抑郁類藥物，也具有一定的抑菌作用，通過(guò)各種處理，確定消除藥品的抑菌性后再進(jìn)行微生物限度檢查是檢驗(yàn)方法篩選的基本原則[9]，但由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中中和劑的加入影響了平皿的觀察計(jì)數(shù)，故舍棄中和劑。若因沒(méi)有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)[3]，故在此次驗(yàn)證中通過(guò)提高稀釋倍數(shù)+薄膜過(guò)濾來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

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