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    花椒cpSSR標(biāo)記開發(fā)及在種間、種內(nèi)的通用性分析

    2019-11-13 02:54:56李思巧劉洪妤張志東王麗華劉玉林
    關(guān)鍵詞:葉綠體竹葉核苷酸

    李思巧,韋 伊,劉洪妤,張志東,張 野,王麗華,劉玉林

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院,陜西 楊凌712100;2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院 生物技術(shù)與良種研究所,四川 成都 610081)

    簡單序列重復(fù)(SSR)廣泛分布于真核生物的核基因組,葉綠體基因組以及線粒體基因組中,常指一類以1~6個核苷酸為重復(fù)基元的串聯(lián)重復(fù)DNA序列[1]。因其分布廣泛、多態(tài)性高且具共顯性,SSR標(biāo)記被廣泛開發(fā)和應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定與遺傳多樣性分析[2-3]。在植物中,由于葉綠體基因組表現(xiàn)為母系遺傳,以半保留方式進(jìn)行自我復(fù)制,幾乎不發(fā)生重組,保守性遠(yuǎn)高于核基因組。因此,葉綠體基因組中的SSR標(biāo)記(chloroplast SSR,cpSSR)可在更高分類水平上進(jìn)行種間、種內(nèi)鑒定和遺傳進(jìn)化分析[4]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,大量植物的葉綠體基因組被測序與公布,相應(yīng)的葉綠體SSR也得到了廣泛的開發(fā)與應(yīng)用[5-7]?;ń穁anthoxylum bungeanum是蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum植物,其果皮曬干后是中國傳統(tǒng)的調(diào)味料和中草藥。在市場上流通的花椒果皮主要來自于花椒Z.bungeanum(又稱紅花椒或大紅袍花椒)和竹葉花椒Z.armatum(又稱青花椒),而在日本主要利用日本花椒Z.piperitum(又稱胡椒木或朝倉花椒)進(jìn)行麻味物質(zhì)和其他藥用活性成分的提取分析[8]。在前人的研究中,基于核基因組內(nèi)部序列差異開發(fā)的 SCAR(sequence-related amplified polymorphism)標(biāo)記[9]、 ISSR(inter-SSR)標(biāo)記[10]和 ESTSSR(expressed sequence tags-SSR)標(biāo)記[11]等已利用到花椒屬植物的遺傳分析中,而cpSSR標(biāo)記在花椒屬植物的開發(fā)與應(yīng)用還未見報道。鑒于此,本研究對花椒cpSSR位點進(jìn)行篩選,分析其分布特點并利用花椒、竹葉花椒和日本花椒種質(zhì)資源開發(fā)多態(tài)性標(biāo)記,以期為花椒屬植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳進(jìn)化分析等提供可靠的標(biāo)記資源。

    1 材料與方法

    1.1 SSR位點搜索與引物設(shè)計

    基于本研究前期獲得的花椒葉綠體基因組序列[12],利用TRF(tandem repeats finder)在線軟件(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)搜索單核苷酸重復(fù)序列,設(shè)置重復(fù)數(shù)≥10次;利用SSRHunter軟件[13]搜索核苷酸重復(fù)數(shù)位為2,3,4,5的SSR位點,對應(yīng)重復(fù)數(shù)設(shè)置為5,3,3,3次。合并2種軟件的檢測結(jié)果,統(tǒng)計1~5 bp核苷酸重復(fù)所在花椒葉綠體基因組中的位置:長單拷貝序列區(qū)(LSC)、短單拷貝序列區(qū)(SSC)和2個反向重復(fù)序列區(qū)(IR)。SSR引物利用Primer3軟件(http://primer3.ut.ee)設(shè)計。原則為:擴增片段為150~250 bp;引物長度為18~22 bp;退火溫度為57~63℃;GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%~55%。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2 種質(zhì)資源采集與DNA提取

    本研究共選用16份花椒屬種質(zhì)資源進(jìn)行SSR多態(tài)性的篩選,其中包括來自中國四川省和重慶市的5份竹葉花椒種質(zhì)資源和1份日本花椒種質(zhì)資源(均采自四川省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)與良種研究所花椒種質(zhì)圃)以及來自四川、貴州、陜西、山東和山西等5個省的10份花椒種質(zhì)資源(均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)鳳縣花椒試驗示范站)進(jìn)行多態(tài)性的篩選(表1)。所有種質(zhì)資源選取3株,取鮮嫩葉片混合,硅膠干燥,常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

    供試種質(zhì)資源全基因組DNA利用 “植物全基因組DNA提取試劑盒(DP305)”(北京天根生物有限公司)提取,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖結(jié)合紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度后稀釋至20 mg·L-1,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 PCR擴增及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    PCR擴增體系為20 μL,包括 10 μL 2×TaqMaster Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司),模板DNA(20 mg·L-1)5.0 μL, 正、 反向引物(2 μmol·L-1)各 1.5 μL, 雙蒸水(ddH2O)2.0 μL。 PCR 擴增程序為: 95℃預(yù)變性5 min;然后95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán);72℃延伸8 min后4℃保存。取1.5 μL的PCR擴增產(chǎn)物,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(恒定功率100 W,100 min)分離檢測,使用pBR322 DNA/MspI Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量,銀染拍照保存。

    表1 供試16份花椒屬種質(zhì)資源來源地Table 1 Origin of 16 germplasms of Zanthoxylum

    根據(jù)電泳圖像,統(tǒng)計擴增條帶并構(gòu)建0~1數(shù)據(jù)矩陣,即有共遷移條帶記為1,無條帶則記為0。利用NTSYSpc-2.10軟件計算遺傳相似系數(shù),采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行遺傳相似性聚類。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 花椒葉綠體基因組中SSR的分布特點

    花椒葉綠體基因組全長為158401 bp,共搜索出了144個SSR位點(圖1和表2),即在花椒葉綠體基因組中平均每隔1100.00 bp出現(xiàn)1個SSR位點。

    根據(jù)SSR位點在花椒葉綠體基因組中的位置(圖1)可知:LSC區(qū)分布85個SSR位點,占SSR總數(shù)的59.03%,平均1010.56 bp出現(xiàn)1個SSR位點;SSC區(qū)分布23個SSR位點,占SSR總數(shù)的15.97%,平均765.65 bp分布1個SSR位點;在 2個 IR區(qū)(IRA和IRB),均分布18個反向重復(fù)的SSR位點,合計占SSR總數(shù)的25.00%,平均1524.72 bp分布1個SSR位點。

    圖1 SSR在花椒葉綠體基因組中的分布特點Figure 1 Distribution of SSRs in the chloroplast genome of Zanthoxylum bungeanum

    數(shù)量上,單核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)分別有62和70個,兩者占SSR總數(shù)的91.67%,且在LSC區(qū)、SSC區(qū)和IR區(qū)均有分布。二核苷酸重復(fù)和四核苷酸重復(fù)分別只有5個(3.47%)和7個(4.86%),但二核苷酸重復(fù)僅分布于SSC區(qū),而四核苷酸重復(fù)僅分布于LSC區(qū)。

    重復(fù)次數(shù)上,單核苷酸重復(fù)次數(shù)多集中在10~15次,共54個位點,占單核苷酸重復(fù)總數(shù)的87.10%,而重復(fù)數(shù)>15次的共有8個位點;二核苷酸重復(fù)數(shù)集中在5次,三核苷酸和四核苷酸重復(fù)數(shù)集中在3次。根據(jù)重復(fù)基元類型,單核苷酸重復(fù)中A/T重復(fù)共60個,而C/G重復(fù)位點僅有2個;二核苷酸重復(fù)基元均為AT/TA;AAG/CTT和AAT/ATT為三核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢重復(fù)基元,均為25個,其余重復(fù)基元總計為20個;此外,AAAT為四核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢重復(fù)基元(3個),其余重復(fù)基元總計為4個(表2)。

    2.2 多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)與通用性分析

    根據(jù)SSR位點兩側(cè)序列,由Primer3軟件設(shè)計了30對引物(命名為YLT-01~YLT-30)并合成。其中,YLT-01~YLT-20擴增片段包含的是2個及2個以上的核苷酸重復(fù)位點(YLT-01~YLT-12位于LSC;YLT-14~YLT-18位于SSC區(qū);YLT-13、19、20位于IR區(qū)),YLT-21~YLT-30擴增片段包含的是單核苷酸重復(fù)位點(YLT-21~YLT-27位于LSC區(qū);YLT-30位于SSC區(qū);YLT-28、29位于IR區(qū))。

    表2 花椒cpSSR的重復(fù)類型與次數(shù)Table 2 Repeat types and times of cpSSR in Zanthoxylum bungeanum

    經(jīng)PCR擴增篩選,30對引物均能擴增出穩(wěn)定的目的片段。其中,10對引物在供試種質(zhì)中呈現(xiàn)多態(tài)性,占篩選引物總數(shù)的33.33%。如表3所示:10對引物共檢測到24個等位基因。其中,YLT-26包含4個等位基因,YLT-21和YLT-29包含3個等位基因,其余的7個位點(YLT-01,YLT-17,YLT-22,YLT-23,YLT-24,YLT-25和YLT-27)均檢測出2個等位基因。在包含2個等位基因的7個位點中,YLT-01,YLT-17,YLT-24,YLT-25和YLT-27能區(qū)分出日本花椒,花椒與竹葉花椒為一類(擴增片段大小一致),而YLT-22和YLT-23的擴增結(jié)果為:10份花椒種質(zhì)同一帶型,竹葉花椒與日本花椒為同一帶型;YLT-21和YLT-29能將花椒、竹葉花椒和日本花椒區(qū)分開;YLT-26不僅能區(qū)分出花椒、竹葉花椒和日本花椒3個花椒屬的不同種,且能區(qū)分出竹葉花椒種質(zhì)中的狗椒。此外,未檢測到有標(biāo)記在10份花椒種質(zhì)呈現(xiàn)多態(tài)性(圖2)。

    在設(shè)計的20對包含2個及2個以上的核苷酸重復(fù)位點的引物中,僅有2對引物表現(xiàn)出多態(tài)性;而包含單核苷酸重復(fù)位點的10對引物中,有8對引物呈現(xiàn)多態(tài)性,多態(tài)性比例遠(yuǎn)高于包含多核苷酸重復(fù)的位點。

    表3 多態(tài)性SSR引物的基本信息Table 3 Characterizations of polymorphic SSR primers pairs

    2.3 聚類分析

    基于10個多態(tài)性標(biāo)記的檢測結(jié)果,利用NTSYSpc-2.10軟件對供試的16份花椒屬種質(zhì)進(jìn)行UPGMA聚類分析。如圖2所示:在遺傳相似系數(shù)閾值為0.22時,可將16份花椒種質(zhì)聚為2類,即花椒和竹葉花椒為1類,日本花椒為1類;在遺傳相似系數(shù)閾值為0.59時,可將花椒和竹葉花椒分為2個小類;而在遺傳系數(shù)閾值為0.91時,可將竹葉花椒中的狗椒與其他4種竹葉花椒種質(zhì)區(qū)分為2個小類。聚類結(jié)果與多態(tài)性標(biāo)記的鑒定結(jié)果保持一致。

    圖2 16份花椒屬種質(zhì)的UPGMA聚類分析Figure 2 Cluster diagram for 16 germplasms of Zanthoxylum by UPGMA method

    3 討論

    本研究在花椒的葉綠體基因組中共篩選到144個SSR位點,其中三核苷酸重復(fù)的數(shù)量要高于單核苷酸重復(fù)以及二核苷酸和四核苷酸重復(fù)的數(shù)量,與楊麗等[14]在麻竹Dendrocalamus latiflorus和綠竹Bambusa oldhamii葉綠體基因組中獲得的SSR位點的規(guī)律一致,但與蒺藜苜蓿Medicao truncatula[15],棉花Gossypium hirsutum[16]和霍山石斛Dendrobium huoshanense[17]等的葉綠體基因組中均以單核苷酸重復(fù)為主不同。原則上,堿基重復(fù)基元越多,越難形成SSR位點。本研究在三核苷酸重復(fù)次數(shù)的篩選上,選擇重復(fù)數(shù)大于或等于3次的位點,而大于3次的重復(fù)位點僅占三核苷酸重復(fù)總數(shù)的11.43%(8個)。因此,本研究的三核苷酸重復(fù)數(shù)量多于單核苷酸重復(fù)是由軟件參數(shù)設(shè)置不同引起。此外,花椒cpSSR在LSC和SSC區(qū)的分布密度要高于IR區(qū)。在花椒葉綠體基因組中,GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)在LSC區(qū),SSC區(qū)和IR區(qū)中分別為36.87%,33.51%和42.54%[12]。由于GC間有3個氫鍵相連,打破GC鍵所需的能量要高于AT間的2個氫鍵,因此更難造成堿基數(shù)量的增加或減少[18]。由此推斷,花椒葉綠體基因組中IR區(qū)SSR位點相對稀疏的原因與GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)。

    葉綠體基因組由于保守性高,不涉及基因重組,因此,其中突變位點也更容易保留,基于葉綠體開發(fā)的SSR標(biāo)記除了保留核基因組SSR標(biāo)記的特點外,其可重復(fù)性也更高,在種質(zhì)資源鑒定中也更具說服力[19]。在本研究獲得的10個多態(tài)性引物中,有2對引物可以把本研究所選花椒屬的3個種區(qū)分開,1對引物可以將竹葉花椒種內(nèi)的 ‘狗椒’區(qū)分出。然而,10對多態(tài)性引物均未在10份花椒種質(zhì)資源中表現(xiàn)出多態(tài)性。由此推斷,相對于竹葉花椒,花椒種內(nèi)的種質(zhì)資源在葉綠體基因組進(jìn)化上保守性更高。

    本研究開發(fā)的花椒cpSSR可作為花椒屬種間鑒定的有效標(biāo)記,但要應(yīng)用于種內(nèi)鑒定,需進(jìn)一步篩選種間多態(tài)性更高的cpSSR標(biāo)記或利用EST-SSR、核基因組SSR(Genomic-SSR)等保守性相對較低的標(biāo)記資源進(jìn)行區(qū)分。

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