小鼠腦代謝物活體磁共振波譜分析及與離體樣本磁共振波譜與質(zhì)譜定量分析的比較研究

陳煒　雷和花　宋濤　張利民　雷皓

摘?要?以水為內(nèi)標的活體質(zhì)子磁共振波譜（1H?MRS）可非侵入性、原位、同時、定量分析多種腦代謝物的濃度，在臨床神經(jīng)/精神疾病診斷、療效評估及相關(guān)基礎研究中得到廣泛應用。為驗證以水為內(nèi)標的活體1H?MRS定量分析的準確性，本研究采集了小鼠紋狀體和內(nèi)側(cè)前額葉腦區(qū)的活體1H?MRS，測定了N?乙酰基天冬氨酸（NAA）、谷氨酸（Glu）、?；撬幔═au）、谷氨酰胺（Gln）和谷胱甘肽（GSH）這5種代謝物的絕對濃度;隨后采集對應腦區(qū)的組織樣本，經(jīng)萃取后用液體核磁共振波譜（1H?NMR）和超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC?MS/MS）法定量分析上述代謝物。經(jīng)統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn)：3種方法所測得的NAA、Glu和Tau的絕對濃度無顯著差異，且與文獻報道一致，提示活體1H?MRS定量分析具有與離體分析基本一致的準確性?；铙w1H?MRS和腦組織萃取樣本1H?NMR定量分析所得的Gln和GSH的絕對濃度無顯著差異。UHPLC?MS/MS測得的Gln和GSH濃度與磁共振方法所得的結(jié)果顯著不同，這可能是在樣品前處理、離子化或定量過程中引入了系統(tǒng)誤差所致。本研究初步驗證了聯(lián)合運用活體1H?MRS和離體磁共振/質(zhì)譜方法對同一腦區(qū)中多種代謝物進行同步定量分析的可行性。

關(guān)鍵詞?質(zhì)子磁共振波譜; 活體分析; 超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜; 絕對定量; 內(nèi)標準

1?引 言

神經(jīng)化學物質(zhì)是大腦對機體生理活動進行精準調(diào)控的物質(zhì)基礎[1]。神經(jīng)/精神疾病的發(fā)生與發(fā)展一般都伴隨有神經(jīng)化學物質(zhì)的代謝紊亂[2，3]。活體、原位、定量分析神經(jīng)化學物質(zhì)（或腦代謝物）的濃度并動態(tài)監(jiān)測其變化軌跡，對于神經(jīng)/精神疾病研究、診斷和療效評估具有重要的意義?；铙w（In vivo）質(zhì)子磁共振波譜（1H?MRS）是現(xiàn)有的為數(shù)不多的可無創(chuàng)定量檢測區(qū)域性腦代謝物濃度的方法之一，已被廣泛應用于神經(jīng)/精神疾?。ㄈ缗两鹕暇C合征，PD）的臨床診斷和基礎研究中[4，5]。利用活體1H?MRS技術(shù)測得的腦代謝物的濃度也被證實與其所在腦區(qū)的結(jié)構(gòu)、功能或病理狀態(tài)有關(guān)[6]。

由于總肌酸（Total creatine， tCr）在正常生理狀態(tài)下一般波動較小，活體1H?MRS一般都選用其作為內(nèi)標進行定量分析[7]。但在某些病理狀態(tài)下， tCr的絕對濃度也會出現(xiàn)顯著變化[8，9]，從而影響定量分析結(jié)果。也有研究者采用水的信號為內(nèi)標進行定量分析[10～12]。但這種方法也存在一些潛在的問題。 首先，腦組織中水的含量和弛豫時間（Relaxation time）在不同個體、不同發(fā)育階段及不同腦區(qū)都可能存在差異[13～15]，從而給絕對定量分析帶來誤差; 其次，腦代謝物的弛豫時間各不相同，且顯著不同于水的弛豫時間，這在比較不同代謝物濃度時可能引入系統(tǒng)誤差[16]。

為驗證以水為內(nèi)標的活體1H?MRS定量分析的準確性和可信度，本研究測定了12月齡DJ?1基因敲除小鼠2個腦區(qū)中5種代謝物的絕對濃度，并與對應腦組織萃取樣本的液體1H?NMR和超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC?MS/MS）方法的定量分析結(jié)果進行了對比。液體1H?NMR用外加已知濃度的3?三甲基硅烷基?2，2，3，3?氘代丙酸鈉（TSP）作為內(nèi)標，UHPLC?MS/MS的定量分析采用外標法，即配制一系列濃度梯度的標準溶液，建立代謝物質(zhì)譜信號響應值與絕對濃度之間的標準曲線。通過比較不同方法定量分析結(jié)果的異同，驗證了聯(lián)合使用活體1H?MRS和離體方法對同一腦區(qū)中多種代謝物進行同步定量分析的可行性。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Bruker 7 T/20 cm Biospec成像儀與AVANCE Ⅲ 500核磁波譜儀（德國Bruker公司）; Agilent 1290型超高效液相色譜儀串聯(lián)Agilent 6460型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國 Agilent公司）; ME204/02型電子分析天平、pH計 FE28型（瑞士Mettler Toledo公司）; 組織破碎儀（德國Qiagen公司）; 低溫離心機（德國Eppendorf公司）; Speed Vac 真空離心濃縮儀（美國Thermo公司）。

色譜純CH3CN、HCOOH、CH3OH、NAA、Glu、Gln、GSH、Tau及重水（D2O，99.9%氘代，含0.05% TSP）均購于Sigma?Aldrich公司。實驗用水為超純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm， 由德國Merck公司 Millipore Elix Advantage 系統(tǒng)制備）。分析純NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O均購于上海國藥集團化學試劑公司。

2.2?實驗動物

DJ?1基因敲除小鼠8只（由北京大學動物中心提供的種鼠繁育），體重（25.0±2.1） g，置于普通小鼠籠內(nèi)，每籠2～3只，在SPF級動物房中飼養(yǎng)至12月齡。所有動物實驗操作均遵從中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所的實驗動物倫理規(guī)范。采集活體1H?MRS時，小鼠用1.0%～1.5%的異氟烷?氧氣混合氣體麻醉，體溫維持在（37SymbolqB@1）℃?；铙w1H?MRS實驗完成后，立即斷頭，剝離大腦，放入液氮中冷凍30 s; 然后切取內(nèi)側(cè)前額葉（mPFC）和紋狀體（Striatum）腦區(qū)組織，置于80℃保存。整個取樣過程在3 min內(nèi)完成。提取的腦組織被均分為2份，分別用于液體1H?NMR和UHPLC?MS/MS實驗。

2.3?活體1H?MRS實驗

采用Bruker 7 T/20 cm Biospec動物磁共振成像儀，直徑為72 mm的射頻發(fā)射體線圈，單通道正交表面接收線圈。使用弛豫增強快速采集（RARE）序列采集定位像。實驗參數(shù)如下：重復時間（TR）2500 ms， 回波時間（TE）36 ms，回波鏈長（RARE factor）4，視野（FOV）20 mm×20 mm，矩陣大小128×128，片厚0.5 mm，片數(shù)20，重復次數(shù)4?；铙w1H?MRS采用單體元譜（PRESS）序列。實驗參數(shù)如下：TR 4000 ms，TE 15 ms，譜寬4000 Hz，采樣點數(shù)2048，帶寬為4000/3000 Hz的Hermit激發(fā)/重聚脈沖，激發(fā)頻率中心偏離水的共振頻率

709 Hz。散相梯度場強度為25 mT/m，持續(xù)時間1.5 ms，所對應的擴散加權(quán)值為0.0178 s/mm2。 采用帶寬為13500 Hz的90°雙曲正割（Sech）射頻脈沖進行體素外信號抑制。勻場后體素內(nèi)水信號的半高寬（FWHM）低于10 Hz。每個腦區(qū)先采集一個重復次數(shù)為1的未壓水的譜，然后采集一個重復次數(shù)為512的壓水后的譜。壓水采用弛豫優(yōu)化的變間隔射頻脈沖技術(shù)[17]。

2.4?腦組織萃取樣本的1H?NMR實驗

每只動物取約3 mg的 mPFC組織和5 mg的紋狀體組織。加入0.6 mL甲醇?水（2∶1， V/V），經(jīng)組織破碎儀（20 Hz，90 s）和冰浴超聲（超聲1 min，停1 min，重復3次）破碎處理; 離心10 min（4℃，12000 r/min），收集上清液; 重復上述步驟2次并合并上清液。上清液用真空離心濃縮儀除去甲醇，冷凍干燥機除去水分。在所得的凍干粉中加入600 μL磷酸鹽重水緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4，0.001% （w/V） TSP，>95% D2O），4℃下12000 r/min離心10 min，取500 μL上清液置于核磁管中。

液體1H?NMR分析在配有超低溫BBO探頭的Bruker AV Ⅲ 500 MHz核磁共振波譜儀上進行，采樣脈沖序列為ZGPR。弛豫等待時間（RD）和壓水預飽和脈沖時間分別為17和2 s，采樣譜寬20 ppm，采樣時間4 s，累加次數(shù)128。樣品溫度保持在298 K。采用1H?13C HSQC二維譜進行質(zhì)子信號歸屬。F2維（1H）與F1維（13C）分別采集2048與200個數(shù)據(jù)點。累加400次，F(xiàn)2維譜寬12 ppm，F(xiàn)1維譜寬175 ppm，壓水預飽和脈沖時間1.5 s，garp組合脈沖去耦。

2.5?UHPLC?MS/MS實驗

每只動物取5 mg左右的mPFC與紋狀體組織，加入0.4 mL冷甲醇（20℃冷凍12 h）、50 μL乙腈?水（1∶1，V/V，含0.1% 甲酸）及10 μL內(nèi)標溶液（氘代乙酰膽堿）后，在組織破碎儀上破碎勻漿（20 Hz，90 s）。于20℃靜止30 min后，在4℃以10000 r/min離心10 min，取上清液離心濃縮揮干。所得粉末加入100 μL乙腈?水（1∶1， V/V），經(jīng)尼龍66針式過濾頭（φ 13 mm，0.22 μL）過濾至色譜樣品瓶。

色譜?質(zhì)譜分析采用Agilent 1290型超高效液相色譜儀串聯(lián)Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH Amide column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。柱溫40℃，流速0.5 mL/min， 進樣量1 μL。流動相A為乙腈?水（1∶1， V/V）; 流動相B為乙腈?水（90∶10， V/V）; 流動相A和B均含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨。采用線性洗脫梯度： ?0 min，100% B; 第5 min開始，逐漸切換為 100% A，平衡時間為3 min。質(zhì)譜儀離子源鞘氣與干燥氣溫度均為350℃，流量均為10 L/min。 正離子檢測模式，毛細管電壓4000 V，噴嘴電壓500 V。標準曲線法進行定量分析，即用5種目標代謝物的標準品配制一系列濃度梯度的混合溶液，在優(yōu)化后的質(zhì)譜條件下做標準曲線。

2.6?數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

活體1H?MRS數(shù)據(jù)采用LCModel 6.3?1A軟件[18]（Stephen Provencher Inc.，奧克維爾，加拿大）處理。經(jīng)相位、基線及渦流矯正等預處理后，采用分峰擬合的方法對各代謝物進行定量分析。未被壓制的水的信號作為內(nèi)標，其絕對濃度設為43300 mmol/kg。當代謝物的擬合不確定性（Cramer?Rao lower bounds，CRLB）低于20%時，所得到的數(shù)據(jù)才被認為可靠并被用于最后的分析。液體1H?NMR數(shù)據(jù)采用Bruker譜儀自帶的TopSpin 3.6.1軟件處理。原始信號先乘以線寬因子為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)后進行傅里葉變換。用TSP信號（δ=0.00 ppm）定標化學位移、手動基線及相位矯正。根據(jù)積分面積計算代謝物濃度。質(zhì)譜數(shù)據(jù)用 Mass Hunter Qualitative software和 Mass Hunter Quantitative software（Agilent， B.06.00）軟件處理。本研究中代謝物濃度均為平均值±標準偏差。Kolmogorov?Smirnov檢驗用于確認濃度數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。統(tǒng)計比較采用以分析方法和腦區(qū)作為獨立變量的雙因素方差分析（Two?way ANOVA）。Sidak事后檢驗評價不同分析方法所得的代謝物濃度的差異。

4?結(jié) 論

本研究利用以水為內(nèi)標的活體1H?MRS定量測量了12月齡DJ?1基因敲除小鼠紋狀體和mPFC這兩個腦區(qū)中5種代謝物的絕對濃度，并將活體分析的結(jié)果與對應腦組織萃取樣本的1H?NMR和UHPLC?MS/MS定量分析的結(jié)果進行了對比。實驗結(jié)果驗證了以水為內(nèi)標的活體1H?MRS定量分析的準確性，同時也初步驗證了聯(lián)合使用活體和離體方法對動物腦區(qū)進行代謝物表型的可行性。

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