正交試驗(yàn)聯(lián)合CCD-RSM優(yōu)化濕熱消顆粒中總黃酮提取工藝研究*

梁國(guó)成,陳舒茵,黃小鷗,方建康,馮文勇,覃 翔,黃 敏,荀建寧

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院(南寧530011)；2.廣西大學(xué)(南寧 530004);3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(南寧530023)

正交試驗(yàn)是目前國(guó)內(nèi)較為常用的用于研究中藥復(fù)方成分的提取工藝的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，采用的是線(xiàn)性的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化[1-2]；星點(diǎn)設(shè)計(jì)(Central composite design,CCD)是一種公認(rèn)的較為科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在國(guó)外應(yīng)用較廣，其主要是基于非線(xiàn)性的數(shù)學(xué)模型的擬合，是一種多因素多水平優(yōu)化設(shè)計(jì)的方法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理可用三維效應(yīng)面(Response surface)進(jìn)行，再此基礎(chǔ)上以非線(xiàn)性方程擬合，即試驗(yàn)預(yù)測(cè)的結(jié)果可在模擬方程的基礎(chǔ)上較好地得到反映[3]。效應(yīng)面優(yōu)化法(Re-sponse surface methodology)亦是國(guó)外流行的一種通過(guò)實(shí)驗(yàn)而尋求最優(yōu)條件的試驗(yàn)方法，較多用于非線(xiàn)性數(shù)據(jù)的處理，此法即通過(guò)回歸方程的擬合，繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線(xiàn)，通過(guò)比較各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)即可簡(jiǎn)便快速的得到各數(shù)值相應(yīng)的響應(yīng)值，從而得到預(yù)測(cè)的響應(yīng)最優(yōu)值，以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件[4]。

慢性前列腺炎(Chronicprostitis，CP)是臨床上常見(jiàn)的男性科疾病之一，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，所有男性科疾病當(dāng)中，CP占比達(dá)1/3，且發(fā)病年齡以20歲至40歲年齡段的青中年居多，超過(guò)50%的男性均出現(xiàn)過(guò)不同程度的CP癥狀[5]。濕熱消顆粒是根據(jù)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院男性科名老中醫(yī)的驗(yàn)方改劑型而制成，由金錢(qián)草，丹參，虎杖等中藥組成，具有清熱利濕、活血消炎的作用，能有效防治CP[6-8]，但關(guān)于濕熱消顆粒防治CP的藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)及其總物質(zhì)的研究未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，總黃酮為防治CP的有效成分之一[9-11]，處方中金錢(qián)草、厚樸、丹參及虎杖等均含黃酮類(lèi)成分，筆者嘗試采用正交試驗(yàn)聯(lián)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法研究其總黃酮的提取工藝。

資料和方法

1 儀 器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，L6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

2 試劑與試藥 濕熱消顆粒處方藥材均購(gòu)自廣西德潤(rùn)堂中藥科技有限公司，槲皮素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，100081-201610，含量測(cè)定用)，乙醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司，分析純)，無(wú)水乙醇(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司，分析純)，AlCl3(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，NaCH3COOH(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，純化水(自制)。

3 研究方法

3.1 對(duì)照品溶液的制備： 取適量槲皮素對(duì)照品，精密稱(chēng)定為10.07 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取25 ml至50 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線(xiàn)，搖勻，即得。

3.2 供試品溶液的制備： 取處方量藥材10 g，按各試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)進(jìn)行提取，合并提取液，過(guò)濾，定容至1000 ml容量瓶，精密量取10 ml供試液，蒸干，精密加入70%乙醇10 ml，定容，超聲1 h，補(bǔ)足損失，過(guò)濾，移至10 ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度線(xiàn)，混勻備用。

3.3 最大吸收波長(zhǎng)的考察： 分別精密量取上述對(duì)照品溶液及供試品溶液各1 ml，置于10 ml容量瓶中，20℃水浴加熱，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反應(yīng)2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫[12]，以相應(yīng)試劑為空白，在200～500 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，槲皮素對(duì)照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均位于442 nm處，且光譜圖基本一致，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為442 nm。

3.4 線(xiàn)性及線(xiàn)性范圍的考察： 精密量取槲皮素對(duì)照品溶液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml分別置于10 ml容量瓶中，20℃水浴加熱，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反應(yīng)2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于442 nm處測(cè)量吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，槲皮素含量(mg)為橫坐標(biāo)(X)，回歸方程為Y=10.395X+0.067，R2=0.9996。

3.5 精密度試驗(yàn)：精密吸取“供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品，在442 nm波長(zhǎng)下，連續(xù)測(cè)定5次，其吸光度的RSD%=0.85%，表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)： 精密吸取“供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品，在442 nm波長(zhǎng)下，分別于0，1，2，4，8，12 h測(cè)定，測(cè)定6次，其吸光度的RSD%=0.79%，表明在測(cè)定時(shí)間(12 h)內(nèi)供測(cè)定樣品的穩(wěn)定性良好。

3.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)：取5份濕熱消顆粒(同一批次)，分別按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下平行制備供試品溶液，依法進(jìn)行操作及測(cè)定，吸光度的RSD%=1.15%，表明本操作及檢測(cè)方法重現(xiàn)性良好。

3.8 回收率試驗(yàn)：取5份供試品(已知含量)并精密稱(chēng)定，分別精密加入槲皮素對(duì)照品，照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，依法測(cè)定吸光度并計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果平均回收率為92.82%，RSD%=2.76%。

3.9 總黃酮的回流提取工藝操作： 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量處方量藥材(事先經(jīng)60℃下干燥2 h)，以規(guī)定量濃度的一定量乙醇浸泡0.5 h，加熱沸騰煎煮至規(guī)定的時(shí)間，濾取藥液后依法再進(jìn)行煎煮，再濾取藥液，與前次所得藥液合并，濃縮、干燥，稱(chēng)取干膏量(g)并測(cè)定其中總黃酮含量(mg/g)，以干膏量及總黃酮含量為指標(biāo)，優(yōu)選影響結(jié)果的各關(guān)鍵工藝參數(shù)。

3.10 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：影響提取工藝的關(guān)鍵因素通常有：提取所用乙醇的濃度(%)、每次提取用溶劑的用量(倍)、沸騰提取的時(shí)間(h)和提取的次數(shù)(次)，故本試驗(yàn)就此四者，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)考察。

表1 總黃酮提取工藝因素水平表

結(jié) 果

試驗(yàn)結(jié)果可直觀分析得到，以干膏得量(g)為觀察指標(biāo)時(shí)，A因素和C因素均對(duì)本試驗(yàn)提取工藝過(guò)程產(chǎn)生有顯著影響，通過(guò)對(duì)比考察的各因素影響主次分別為：A>C>B>D，即乙醇濃度>提取時(shí)間>溶劑用量>提取次數(shù)；直觀分析得知，各因素中：A2>A3>A1，B3>B1>B2，C3>C2>C1，D3>D2>D1，即組合為A2B3C3D3。

以總黃酮含量(mg/g)為指標(biāo)時(shí)，A因素對(duì)本試驗(yàn)提取工藝過(guò)程產(chǎn)生有顯著影響，通過(guò)對(duì)比考察的各因素影響主次為：A>B>C=D，即乙醇濃度>溶劑用量>提取時(shí)間=提取次數(shù)；直觀分析得知，各因素中：A3>A2>A1，B3>B1>B2，C1>C3>C2，D2>D1>D3，即組合為A3B3C1D2。

據(jù)綜合表3直觀分析結(jié)果及綜合考慮各因素對(duì)提取的貢獻(xiàn)率以及能源損耗與工藝耗時(shí)等因素，在干膏中總黃酮含量相差不大的情況下，以干膏得量為主要指標(biāo)。綜上所述，最佳提取工藝組合為A2B3C3D2，即用12倍量的60%乙醇提取2次，每次提取2 h。

表2 總黃酮提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

表3 總黃酮提取工藝直觀分析結(jié)果

表4 總黃酮提取工藝干膏得量方差分析結(jié)果

表5 總黃酮含量方差分析結(jié)果

注：F0.01(2,2)=99.0；F0.05(2,2)=19.0；F0.10(2,2)=9.0

1 提取工藝驗(yàn)證 準(zhǔn)確稱(chēng)取3批處方量藥材(已于60℃下干燥2 h)，以12倍量乙醇(60%濃度)浸泡0.5 h，沸騰提取2次，每次2 h，濾取藥液后合并2次提取液，濃縮、干燥，稱(chēng)取干膏得量并計(jì)算其總黃酮含量，結(jié)果平均干膏得量為12.0639 g，RSD=2.17%；平均總黃酮含量為35.1558 mg/g，RSD=1.01%。證實(shí)所選工藝穩(wěn)定、可靠。

2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 因提取次數(shù)為非連續(xù)性的，而星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)各因素應(yīng)是連續(xù)性的，故本次試驗(yàn)暫定提取次數(shù)為2次，考察乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)和提取時(shí)間(C)，以干膏得量與總黃酮含量為指標(biāo)，綜合評(píng)分。根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)的原理，每因素設(shè)置5水平，各因素極大、極小水平值根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)立，代碼分別為±α，±1，0，再遵循“任意兩個(gè)物理量之間的差值與對(duì)應(yīng)代碼之間的差值呈等比關(guān)系”的原則安排試驗(yàn)的水平，通過(guò)建立相關(guān)的模型擬合效應(yīng)及因素，進(jìn)而可以直觀地描繪得到三維效應(yīng)面，最后可從較優(yōu)的效應(yīng)面區(qū)域中快速地讀取本次試驗(yàn)最佳的工藝條件[13]。采用Design Expert 10.0.7軟件安排實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6～8。

采用多元線(xiàn)性模型對(duì)各影響因素和指標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，方程為R1=+88.73+5.56×A+4.38×B+1.29×C(R2=0.6816，P<0.05)。采用二次多項(xiàng)非線(xiàn)性模型對(duì)各影響因素和指標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，方程如下：R1=+96.76678+5.55837×A+4.38024×B+1.28578×C+2.36625×A×B+0.053750×A×C+0.84875×B×C-5.50696×A2-4.14754×B2-2.12168×C2(R2=0.8324，P<0.01)

采用Design Expert 10.0.7軟件繪制模型中任意兩因素對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)的效應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖，分析結(jié)果可知，多元線(xiàn)性回歸模型擬合度不佳，預(yù)測(cè)性不理想。對(duì)各因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，方程擬合度良好，表明模型能較好且誤差較小的反映響應(yīng)值的變化，且具有顯著影響，可較好的對(duì)提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)的三因素的最優(yōu)條件所在區(qū)域?yàn)椋篈：60%～70%，B：11～12倍量，C：105～115min；考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了微調(diào)，最終優(yōu)選的處方為A(乙醇濃度)為以11倍量65%乙醇進(jìn)行提取2次，每次110 min。

表6 總黃酮提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素及水平表

表7 總黃酮提取工藝星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表8 二次多項(xiàng)回歸方程方差分析結(jié)果

注：*P<0.05，△P<0.01， ◇P<0.0001

處方驗(yàn)證：根據(jù)優(yōu)化出的處方，依法制備了3批樣品，進(jìn)行驗(yàn)證，并以公式“偏差=(預(yù)測(cè)值-實(shí)際值)/預(yù)測(cè)值×100%”計(jì)算偏差[14-15]，結(jié)果實(shí)際值和預(yù)測(cè)值偏差絕對(duì)值均小于5%，表明試驗(yàn)所得到的結(jié)果達(dá)到預(yù)期目的。

討 論

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是目前國(guó)內(nèi)比較成熟的、用于研究多因素、多水平的一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能夠極大的減少試驗(yàn)次數(shù)且不會(huì)降低試驗(yàn)的可行性，其根據(jù)試驗(yàn)的正交性，從整體試驗(yàn)過(guò)程中，有針對(duì)性的選擇部分有代表性的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)比較，所選的試驗(yàn)點(diǎn)具有“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)。正交表是將預(yù)試驗(yàn)中所選的影響試驗(yàn)的各水平和因素組合排列成相應(yīng)的表格，開(kāi)始由日本著名的統(tǒng)計(jì)學(xué)家田口玄一提出，經(jīng)廣泛的應(yīng)用證實(shí)，其能夠極大程度的減少試驗(yàn)次數(shù)，減少試驗(yàn)的工作量，為廣大科研工作者所接受和采用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和科研等很多領(lǐng)域的研究中[16-17]。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是國(guó)外常用的用于優(yōu)化非線(xiàn)性擬合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，采用歸一化幾何平均數(shù)法處理數(shù)據(jù)，能夠消除各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)單位或量綱不同所引進(jìn)的不確定因素，預(yù)測(cè)能力強(qiáng)、精度高[18-19]，且利用對(duì)應(yīng)軟件建立模型，繪制三維效應(yīng)曲面關(guān)系圖，并可旋轉(zhuǎn)，能夠更好、更直觀的解決目前國(guó)內(nèi)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法試驗(yàn)精度不夠、不能靈敏的體現(xiàn)各因素間交互作用等缺點(diǎn)[20]。本試驗(yàn)通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選最佳取值區(qū)域，并選取最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明該組數(shù)據(jù)帶入最佳模型方程獲得的理論預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較吻合，證實(shí)所建立的數(shù)學(xué)模型具有較好的預(yù)測(cè)性，表明采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化本制劑中總黃酮的提取工藝，達(dá)到實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)同步優(yōu)化的目的是可行的。