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    宮頸感染高危型人乳頭瘤病毒后microRNAs的表達(dá)及其臨床意義*

    2019-11-12 07:17:26張星瑩楊春娜解水杉孫曉娟李連芹
    實(shí)用醫(yī)藥雜志 2019年11期
    關(guān)鍵詞:危型細(xì)胞系雜交

    張星瑩,楊春娜,于 慧,解水杉,孫曉娟,李連芹

    盡管高危型人乳頭瘤病毒 (human papillomavirus,HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因,但宮頸癌發(fā)病是一個(gè)多因素參與、多步驟進(jìn)行的慢性過程。微小 RNAs(microRNA,miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA,通過與相關(guān)靶基因結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而參與細(xì)胞的各種生理病理過程,如細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等。近十幾年來,miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥性等方面的作用一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題。大量的研究表明,很多種miRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)發(fā)生異常[1,2],這些異常表達(dá)的 miRNA 與宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān),甚至可以作為預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[3-5]。 該研究對(duì)感染HPV16的宮頸上皮細(xì)胞 (未發(fā)生癌變或癌前病變)中miRNA的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè),以探討miRNA在宮頸癌發(fā)病中的作用。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料及來源該研究獲得濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者知情同意。宮頸上皮組織來自因子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜異位癥接受手術(shù)治療的患者,穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6/E7的宮頸上皮永生化細(xì)胞系(H8)購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。HPV檢測(cè)試劑盒由香港凱普公司生產(chǎn),提取RNA用Trizol試劑購自美國(guó)Invitrogen公司,miRNA分離試劑盒購自美國(guó)Ambion公司,SYBR Green miRNA qRT-PCR試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司。

    1.2方法

    1.2.1 宮頸感染HPV狀況的檢測(cè) 利用HPV檢測(cè)試劑盒測(cè)定宮頸組織的HPV感染狀況。從宮頸組織中提取RNA并通過PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物與雜交膜(含有21種HPV亞型探針,其中高危型15種,低危型6種)進(jìn)行雜交,雜交膜通過NBT/BCIP顯色,以確定HPV的感染與否及分型。

    1.2.2 miRNA表達(dá)的微陣列分析 微陣列探針是一種寡聚核苷酸,其堿基序列與435種人類miRNA的堿基序列互補(bǔ)。首先從宮頸組織中提取總的RNA,再利用miRNA分離試劑盒分離出微小RNA,利用T4 RNA 連接酶進(jìn)行標(biāo)記,最后將含有1.5 μg的雜交液與微陣列雜交膜在42℃下雜交。次日經(jīng)清洗、空干之后,利用LuaxScan 10K/A 掃描儀(北京博奧公司生產(chǎn))及微陣列顯著性分析軟件(significance analysis of microarray,SAM,version 2.1)對(duì)基因芯片進(jìn)行分析,以量化miRNA的表達(dá)差異。

    1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析 為了驗(yàn)證微陣列分析結(jié)果,利用SYBR Green miRNA qRT-PCR試劑盒對(duì)表達(dá)異常的miRNA進(jìn)行定量分析。上游引物序列與待測(cè)基因的序列完全相同,下游引物是由廠家提供的通用引物。PCR反應(yīng)條件為:95℃3 min,95℃15 sec,60 ℃ 1 min×40; 反 應(yīng) 量 為 50 μl。 每 個(gè)miRNA的表達(dá)水平是相對(duì)于U6的相對(duì)表達(dá)量,計(jì)算公式為 2-ΔCt×106,其中 Ct代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),ΔCt為每個(gè)miRNA基因與U6的閾值循環(huán)數(shù)之差,即ΔCt=(CtmiRNA-CtU6)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理,所測(cè)miRNA的表達(dá)強(qiáng)度以(x±s)表示。對(duì)于兩組間年齡比較,采用t檢驗(yàn)法;對(duì)于miRNA表達(dá)水平的比較,采用單因素方差分析。取P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1患者一般資料該研究選取了10例單純感染HPV16的宮頸標(biāo)本,其病理學(xué)檢查未見異常?;颊叩钠骄挲g(48.5±1.8)歲。另外,選取10例HPV陰性的正常宮頸作為對(duì)照,其平均年齡(49.8±1.2)歲。兩組病例的年齡無明顯差異。

    2.2 miRNA的表達(dá)差異根據(jù)SAM的解釋,如果挑選表達(dá)差異在5倍以上的基因,可能會(huì)有1個(gè)基因是假陽性。而如果挑選表達(dá)差異在3~5倍之間的基因,可能會(huì)有2~3個(gè)基因是假陽性。因此,筆者挑選了表達(dá)差異在5倍以上的基因,而且這種差異出現(xiàn)在6個(gè)以上的所測(cè)標(biāo)本中。如表1所示,在HPV16 陽性的宮頸標(biāo)本中,miR-133a,miR-133b,和miR-196a的表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著降低。

    表1 miRNA在HPV16型陽性的宮頸標(biāo)本中的表達(dá)差異倍數(shù)

    2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果為了驗(yàn)證微陣列分析結(jié)果,筆者采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)上述3個(gè)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。如圖1所示,miR-133a,miR-133b,和miR-196a在HPV16陽性的宮頸中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組,而且在H8細(xì)胞系中表達(dá)降低更加明顯。

    3 討論

    圖1 miRNA的表達(dá)比較

    截至目前,大多數(shù)有關(guān)miRNA與腫瘤相關(guān)性的研究集中于癌癥患者或者腫瘤細(xì)胞,而miRNA在腫瘤發(fā)病起始階段的作用卻鮮見報(bào)道。在宮頸癌發(fā)病過程中,高危型HPV的致癌基因與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合是非常關(guān)鍵的一步。該研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)miRNA,其表達(dá)在感染HPV16的宮頸細(xì)胞中顯著降低。H8是一種永生化的宮頸上皮細(xì)胞,其中HPV16的E6/E7基因與宮頸上皮細(xì)胞的基因組發(fā)生了整合。miR-133a、miR-133b、miR-196a在 H8細(xì)胞系的表達(dá)進(jìn)一步降低,提示這些基因與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。

    眾所周知,高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要因素,而HPV的致癌基因與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合是其中的關(guān)鍵步驟之一。研究發(fā)現(xiàn),HPV的致癌基因與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合的位點(diǎn)常??拷赾-Myc基因。之前的研究報(bào)告提出,HPV的致癌基因E6/E7和c-Myc直接作用于包括 miRNA-196 在內(nèi)的多個(gè) miRNA[6,7],而 miRNA-196則對(duì)Hoxb8基因發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用[8]。Hoxb8是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)控細(xì)胞的分化[9]。因此推測(cè)HPV致癌基因與c-Myc、miR-196和Hoxb8之間,在宮頸癌的發(fā)病過程中存在相互作用關(guān)系。在該研究所確認(rèn)的3個(gè)miRNA中,miR-133a和miR-133b在各種不同的腫瘤中的表達(dá)均降低。國(guó)內(nèi)學(xué)者Song等研究發(fā)現(xiàn),miR-133a通過表皮生長(zhǎng)因子受體抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10],而根據(jù)Patron等人的報(bào)告,miR-133b在宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中具有促凋亡作用[11]。miR-133a和miR-133b在HPV16陽性的宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)降低,提示此類細(xì)胞的凋亡可能受到抑制,或者有利于細(xì)胞的生長(zhǎng),其結(jié)果促進(jìn)了HPV致癌基因的復(fù)制和整合,進(jìn)而在其他因素的作用下發(fā)生癌變。其中詳細(xì)的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

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